Anvendelse af en monocyt Monolayer Assay til Evaluer Fcy receptor-medieret fagocytose

Summary

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis.

Abstract

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express FcγRs (e.g., FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, and FcγRIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of FcγR-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate FcγRs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out FcγR-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo FcγR-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of FcγR-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Introduction

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay originally developed to better predict blood transfusion outcomes in patients with auto- or alloantibodies to red blood cells (RBCs)^1-5. By assessing the effect of anti-RBC antibodies in mediating Fcγ receptor (FcγR)-mediated phagocytosis using this in vitro assay, it is possible to predict the clinical outcome in vivo. Indeed, the MMA has been used successfully to avoid immune destruction of antibody-bound RBCs, despite the transfusion of serologically incompatible blood⁵. The typical pre-transfusion procedure for compatibility testing, also termed crossmatching, involves serological methods that include typing the patient’s blood for ABO and Rh antigens and screening for the presence of anti-RBC antibodies in the patient⁶. Blood matched for ABO/Rh is selected, and if antibodies are present, an attempt to identify them is made so that blood for transfusion can be further selected to avoid these antigens. An ideal crossmatch result occurs when all donor blood is serologically compatible with the patient’s blood, which reduces the risk of post-transfusion hemolysis⁷. However, this system falls short for the small group of patients who have become alloimmunized upon repeated transfusion or pregnancy. These patients produce alloantibodies against specific RBC antigens. Some produce antibodies to antigens of very high frequency in the general population, and thus become progressively more difficult to crossmatch^8,9. Adding to the complexity, not all alloantibodies are clinically significant; in other words, the binding of an alloantibody to RBCs detected by a serology test does not necessarily result in hemolysis when antigen-positive, incompatible blood is transfused. The MMA was originally developed to assess the potential clinical significance of serologically incompatible blood in a transfusion setting^1-5.

Since extravascular hemolysis of antibody-bound RBCs is known to be mediated by the mononuclear phagocyte system, primary monocytes/macrophages are utilized in the development of diagnostic assays. The first assay to study the interaction of monocytes, RBCs, and antibodies was published in 1975, but the sub-optimal conditions used led only to rosette formation (the binding of RBCs to the periphery of the monocyte), and no phagocytosis was observed¹⁰. Significant modifications to the assay were made by several groups, leading to an assay for which the level of phagocytosis of alloantibody-bound RBCs could be correlated to the clinical outcome of hemolysis^1-5. Recently, the optimal storage conditions of clinical samples and further optimization of assay conditions were examined to enhance the utility of a clinical MMA crossmatch using autologous patient samples¹¹.

Three other diagnostic techniques have been employed in addition to the MMA in predicting transfusion outcomes: the ⁵¹Cr release test, the rosette test, and the chemiluminescence test (CLT). In the ⁵¹Cr release test, the patient is injected with ⁵¹Cr-labeled donor RBCs, and the half-life of the labeled RBCs is monitored and is predictive of post-transfusion survival or clearance^12,13. As this method uses radioactive materials, it is rarely performed anymore. The rosette test involves mixing and incubating monocytes with RBCs and quantifying the level of rosette formation (with no phagocytosis)¹⁴. The clinical significance of antibodies in vivo involves active phagocytosis by macrophages found in the spleen and/or the liver; thus, this method does not provide a relevant readout of phagocytosis. The CLT uses luminol to monitor the oxidative burst during monocyte phagocytosis of RBC, since luminol fluoresces blue when oxidized in the phagosome¹⁵. This method is good, but contamination by neutrophils can confound the readout. Parallel comparisons have been made to evaluate the sensitivity, practicality, and reproducibility of the four available methods, and both the CLT and MMA were ranked superior¹⁶. However, the CLT has been mainly utilized in assessing hemolytic disease of the fetus and newborn (HDFN), and the assay’s optimal pH of 8.0 might compromise the level of phagocytosis¹¹.

In addition to its diagnostic and clinical utility, the MMA has been modified for other research purposes. Indeed, the MMA can not only serve as a functional assay to address discrepancies between serology and biology, it has also been used to retrospectively investigate the cause of hemolysis after intravenous immunoglobulin (IVIG) therapy¹⁷. It has also been used to examine the structure-function of chemical inhibitors of FcγR-mediated phagocytosis^18-20 and to study the downstream signaling of FcγR-mediated phagocytosis²¹. In our laboratory, in addition to using a human MMA, we are developing a murine MMA using primary mouse peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and autologous RBCs. The rationale is to screen antibodies that can induce FcγR-mediated phagocytosis as an intermediate to developing an in vivo autoimmune hemolytic anemia (AIHA) mouse model (unpublished data). The various modifications focus on different aspects of the IgG antibody and FcγR interaction that induce phagocytosis.

Protocol

Opnå godkendelse til anvendelse af humane prøver af forskningsetik bord / institutionel gennemgang bord, og få underskrevet samtykke fra alle menneskelige donorer. MMA kan også udføres ved hjælp af musen PBMC'er på en lignende måde som den humane assay efter brug Dyreetiske godkendelse. MMA udnytter aseptiske vævsdyrkningsteknikker. BEMÆRK: Se figur 1. BEMÆRK: Selvom vi anbefale brug af et niveau 2 biologisk indeslutning skab under analysen at fastholde aseptisk teknik, da metoden er kun en "kortsigtet" kultur metode, der er ikke rigtig tid nok for bakterier at forurene analysen. Derfor, hvis et niveau 2 biologisk indeslutning kabinet ikke findes, frem for at købe en bare for denne analyse, analysen kunne udføres uden for en biologisk indeslutning kabinet, på en åben bænk. Anvendelsen af en 37 ° C inkubator med 5% CO2, er imidlertid ikke en mulighed, og skal anvendes tiloptimale resultater. 1. perifere mononukleare Cell Isolation Opnå humant helblod fra en rask donor eller en patient via venepunktur under anvendelse vakuumbeholdere, der indeholder syre-citrat-dextrose (ACD) antikoagulant (gul-top tubes). BEMÆRK: Helblod kan opbevares i ACD ved stuetemperatur (18-22 ° C) i op til 36 timer før man går videre til det næste trin 11. Normalt 1-2 10 ml vakuumbeholderrør fuldblod er tilstrækkelige til assayet. Fortynd helblodet 1: 1 volumen / volumen i varmt komplet RPMI-medium (RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 20 mM HEPES og 0,01 mg / ml gentamicin). Isoler mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) fra den fortyndede fuldblod hjælp densitetsgradientcentrifugering, som anbefalet af producenten (se listen over Materials). Lag det fortyndede blod meget langsomt over densitetsgradient (opvarmet til stuetemperatur, 18-22 ° C). BEMÆRK: Minimer mængden af ​​mixing ved grænsefladen for optimal separation af blod ved omhyggeligt lagdeling af blandingen blod på en dråbevis måde eller ved anvendelse af en pipette. Tillad blodet blandingen til langsomt lag over toppen af ​​densitetsgradient ved at placere pipettespidsen tæt på tæthedsgradienten og ved at muliggøre blanding blodet at løbe ned ad siden af ​​røret meget langsomt. Afhængigt af omfanget af eksperimentet lag 10 ml blod blanding oven på 3 ml densitetsgradient (i en 15-ml rør) eller lag 35 ml blod blanding oven på 15 ml densitetsgradient (i en 50-ml rør). Typisk 10 ml fuldblod giver 10 millioner PBMC'er, med nogle donor-til-donor variation. BEMÆRK: Det er meget vigtigt, at der ikke sker nogen sammenblanding af blodet blandingen med densitetsgradient. Blodblandingen bør lag over densitetsgradient og langsomt stige indtil alt blodet er på toppen af ​​densitetsgradient. Centrifugeres den lagdelte blanding ved 700 xg i 30 min uden bremser. Det centrifuged blanding bør adskille i 5 lag (fra top til bund): plasma, buffy coat (indeholdende PBMCer), densitetsgradient materiale, granulocytter, og RBC. Fjern og kassér størstedelen af ​​plasmaet og omhyggeligt hente indhold buffy coat (PBMC) i en ny 15-ml rør under anvendelse af en Pasteur pipette og en suge pære. BEMÆRK: Fjernelsen af ​​buffy coat lag effektivt gøres ved at anvende sugning på Pasteur-pipette, mens de udfører en cirkulær bevægelse omkring ydersiden af ​​laget, med spidsen af ​​pipetten mod røret. Vask de isolerede PBMC'er tre gange i pH 7,3 phosphatbufret saltvand (PBS) ved centrifugering ved 350 xg i 10 min (med fuld bremser) i mellem vaskene. Rekonstituer PBMC pellet i komplet RPMI-medium. Afhængig af størrelsen af ​​pelleten, 3-7 ml medium er tilstrækkelig. Tæl PBMC hjælp trypanblåt og et hæmocytometer. Kun tælle de celler, der ikke er farvet med trypanblåt. Reconstitute PBMC'erne til 1.750.000 celler / ml i komplet RPMI medium. Seed 400 pi (700.000 celler) i hver brønd på en 8-kammer slide. Inkubér objektglasset i en 37 ° C, fuldt befugtet vævskultur inkubator (suppleret med 5% CO2) i 1 time for at tillade monocyt / makrofager til at klæbe. 2. Forbehandling af levet Monocytter BEMÆRK: Dette trin er kun nødvendigt, hvis udkig efter måder at hæmme eller øge fagocytose. Pre-treat levet monocytter med et lægemiddel (er) eller forbindelse (r) af interesse. Rekonstituere lægemidlet (er) eller andet prøvemateriale til den ønskede koncentration ved anvendelse komplet RPMI-medium. BEMÆRK: For eksempel er 200 pg / ml IVIG typisk anvendes til dannelse af en 95-100% hæmning af fagocytose, når der anvendes humane monocytter. Aspirer og kassér supernatanten indeholdende alle ikke-adhærente celler fra 8-kammer slide efter 1-times inkubation (efter trin 1.6). Udskift den med 400pi af et lægemiddel eller en anden behandling, og der inkuberes i 1 time ved 37 ° C. Når opsugning og udskiftning løsninger i 8-kammer dias, skal du sørge for at kontrollere strømmen af ​​væsker så svagt adhærerede celler ikke lift off. Også arbejde med kun 2-3 tomme brønde ad gangen og undgå udtørring af brøndene. BEMÆRK: Typisk er hver behandling udført i tekniske triplikater. 3. opsonisering af R 2 R 2 røde blodlegemer BEMÆRK: R2 R2 bruges her fås fra Blood Collection Center (Canadian Blood Services), men de er også kommercielt tilgængelige. Opsoniseret R2 R2 RBC'er anvendes som en positiv kontrol for FcyR-medieret fagocytose. Naive R2 R2 bør opbevares i Alseversopløsning (at forlænge holdbarheden) ved 4 ° C i op til 1 måned. Alseversopløsning er foretaget internt og sammensat af 0,8% W / v trinatriumcitrat (dihydrat), 1,9% vægt / volumen dextrose, 0,42% vægt / volumen natriumchlorid og 0,05% vægt / volumen citronsyre (monohydrat). Hvis R2 R 2 celler er ikke tilgængelige, andre Rh-fænotype celler, såsom R1 R2, R1 R1, R1 R, eller R2 r, kan anvendes. Wash R2 R2 (CDE / CDE) røde blodlegemer i PBS i alt tre gange ved anvendelse af centrifugering ved 350 xg i 5 min hver. BEMÆRK: Mængden af ​​røde blodlegemer, der er nødvendige, afhænger af den eksperimentelle størrelse og kan være tilbage-beregnet. Vask altid en overskydende mængde af RBC'erne, eftersom RBC tabes under hver vask som følge af lysis eller under fjernelse af supernatanten. For eksempel i et eksperiment med 5 behandlinger og 2 kontroller alle gennemført i tekniske tre eksemplarer, der er i alt 21 brønde. 21 brønde med 400 uL / ​​brønd af 1,25% RBC blanding angiver, at 105 pi pakket, opsoniseret RBC er nødvendige. 200 pi RBC bør indledningsvis vaskes og 150 & #181; L bør opsoniseret at sikre, at der er en tilstrækkelig mængde af RBC'er for fagocytose trin. Opsonisere den vaskede R2 R2 pellet med 1: 1 v / v polyklonale anti-D-antistoffer fra humant serum og inkuberes i 1 time ved 37 ° C, med intermitterende blanding. BEMÆRK: Hvis polyklonale anti-D-antistoffer ikke er tilgængelige, er det muligt at anvende monoklonale anti-D-antistoffer, som er kommercielt tilgængelige, eller anti-D, der normalt bruges til Rh immun profylakse, som kan opnås fra blodbanker eller transfusion tjenesteydelser. Optimering test bør udføres i begyndelsen, når opsætning af analysen, og når du skifter masser af un-titer polyklonale antistoffer eller skifte til et monoklonalt antistof. Dette er for at identificere den optimale koncentration eller mængde af anti-D kræves for en antiglobulintest (IAT) resultat på mellem 3+ og 4+ og en fagocytose resultat på mellem 70-90 fagocyterede RBC per 100 monocytter tælles. Vask opsonisered R2 R2 i alt tre gange i PBS ved hjælp af centrifugering ved 350 xg i 5 min hver. BEMÆRK: Vellykket opsonisering af R2 R2 kan bekræftes ved at udføre en indirekte IAT. Kort fortalt tilsættes sekundære polyklonale anti-humane antistoffer til at binde primære opsoniserende antistoffer på RBC overflader, og det forstærkede signal kan observeres i form af hæmagglutinering. En detaljeret fabrikant protokol kan findes i den supplerende materialer filen. Rekonstituer den vaskede R2 R2 pellet til 1,25% v / v under anvendelse af komplet RPMI-medium. BEMÆRK: Overskydende opsoniseret R2 R2 kan lagres i Alseversopløsning ved 4 ° C i op til en uge. 4. Fc Receptor-medieret fagocytose Aspirer lægemiddel eller medium supernatant fra 8-kammer slide og tilsæt 400 pi af 1,25% v / v R2 R2 blanding. Der inkuberes ved 37 ° C i 2 timer. AftER 2 timers inkubation fjernes kamrene ved hjælp af producentens adaptere. Dup overskydende R2 R2 på et stykke køkkenrulle. Sørg for, at dias ikke tørrer ud. Fyld en 100-ml bæger med PBS. Sænk og vaske dias ved langsomt bevæger slæden frem og tilbage (omkring 30-40 slag) til at fjerne hovedparten af un-fagocyteret R2 R2. Fjern side fra PBS. Dup overskydende PBS ved hjælp af et papir håndklæde eller køkkenrulle og air-tørre dias. Fastgør lufttørret dias i 100% methanol i 45 s. Så, air-tørre den faste dias. BEMÆRK: Slides kan fastgøres ved hjælp af en anden metode, der er mere kompatibel for downstream farvning, såsom Grünwald-Giemsa farve 21 eller Wright-Giemsa farve 22. Monter dias hjælp af en in-house-made Elvanol montering medium (eller en anden kommercielt tilgængelig montering medium) og tilføje dækglas. BEMÆRK: Elvanol monteringsmedium er sammensat af 15% vægt / volumen polyvinyl alkohol harpiks og 30% v / v glycerol i PBS. Blandingen opvarmes, indtil alle harpiksen er opløst og glycerinen er homogent blandet. Dette kan erstattes med andre kommercielt tilgængelige mounting medium. Lad mount tørre natten før kvantificering. 5. Kvantificering af Fagocytose Ved hjælp af en fase-kontrast mikroskop og en 40X objektiv, manuelt kvantificere mængden af fagocytiske begivenheder ved at tælle mindst 200 monocytter og antallet af fagocyteret R2 R2 inden for disse monocytter. Har en tæller i hver hånd til samtidig kvantificering af antallet af monocytter og antallet af fagocyteres R2 R2. Få den gennemsnitlige fagocytisk indeks ved at dividere antallet af fagocyteres R2 R2 med antallet af monocytter og gange med 100. Express dataene som middelværdien (gennemsnitlige fagocytisk indeks) ± standardfejlen på middelværdien (SEM). </li>

Representative Results

Ved at følge de afgørende trin i figur 1 og proceduren skitseret ovenfor, kan MMA reproducerbart udføres. IVIG blev brugt som et eksempel til inhibering af fagocytose i figur 2. IVIG vides at binde og blokere Fc-receptorer, hvilket forhindrer den nedstrøms resultat af fagocytose. Ved titrering af mængden af IVIG anvendes, en dosisafhængig hæmning observeret, hvor koncentrationer over 200 mg / ml resulterede i tæt på 100% hæmning og koncentrationer under 0,5 mg / ml ikke hæmme overhovedet (figur 2A). Når fagocytiske indeks transformeres og normaliseret til R2 R2 positiv kontrol som 0% inhibering, en inhibering kurve med en IC50 på 3 pg / ml kan bestemmes (figur 2B). Ud over at udføre assayet konsekvent, quantification af assayet kan undertiden være vanskeligt. Figur 3 er en samling af fasekontrastmikroskopi billeder af forskellige MMA lysbilleder. Med mikroskopi erfaring, kan man skelne en monocyt fra en kontaminerende RBC (figur 3D), eller et vacuolen fra en fagocyteres RBC (figur 3B). Tætte klynger af celler og / eller rester bør undgås under kvantificering (figurerne 3E og F). Desuden bør man undgå overdreven opsoniserende R2 R2 RBC, hvilket ville føre til øget fagocytose der overcrowds monocyt- indre og forstyrrer nøjagtig kvantificering (figur 3C). Figur 1. Skematisk diagram af MMA. En trin-for-trin skildring af de afgørende skridt i MMA: isolerer PBMC fra fuldblod, fodre levet monocytes med opsoniseret R2 R2 og vask af kammerskiver. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Intravenøs IgG (IVIG) inhiberer fagocytose in vitro under anvendelse af MMA. IVIG er kendt for at hæmme fagocytose og anvendes som en inhibering kontrol i den humane MMA. (A) Titrering af IVIG resulterede i en dosisafhængig inhibering af fagocytose sammenlignet med den ubehandlede R2 R2 kontrol. Resultaterne viser gennemsnittet ± standardfejlen på middelværdien (SEM) af n = 3 eksperimenter. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af Student t-test: ** P≤0.01 og *** P≤0.001. (B) Inhibition kurve af IVIG med en IC50 of 3 ug / ml (stiplet linje). Resultaterne viser data normaliseres til ubehandlet R2 R2 (0% inhibering); middelværdi ± SEM af n = 3 eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 3. Fase kontrast mikroskopi billeder af prøven glider under 40X forstørrelse. (A) Den perfekte dias, hvor monocytter fagocyteret 1-2 R2 R2 i gennemsnit (sorte pile med en karakteristisk glorie glød), med meget få forurenende, un-fagocyteret R2 R2 i baggrunden (hvide pile). (B) Som det fremgår af denne slide, monocytter tider har udvidet vakuoler (hvide pile), som kan forveksles med fagocyteret R2 R2. (C </ strong>) Når R2 R2 har været over-opsoniseret, mere end 4-5 fagocyteret R2 R2 pr monocyt (sorte pile) gør nøjagtig tælle vanskelig, da R2 R2 er overfyldt i monocyt- og særskilte celle grænser kan ikke skelnes. (D) Utilstrækkelig vask af dias fører til rigelige R2 R2 forurening (hvide pile), som kunne forveksles med overholdes RBC. (E) Undertiden, monocytter og kontaminerende RBC'er kan danne klynger. Klynger også indikerer bakteriel forurening, hvilket bør undgås. (F) Monocytter kan danne større aggregater, der bør undgås under kvantificering. Brug tilfældig udvælgelse af felterne for at se, panel A er, hvad der normalt observeres, hvis MMA er blevet udført korrekt. Scale bar er 20 um. Klik herfor at se en større version af dette tal.

Discussion

MMA er en arbejdskrævende teknik, der kræver ekspertise i både vævskultur og mikroskopi. Der er flere kritiske skridt til at sikre succes: 1) generation af monocyt monolag; 2) opsonisering af RBC'erne, og 3) manuel kvantificering. Den monocyt monolag klæber ikke meget kraftigt til kammeret dias, så fysiologisk pH skal opretholdes i hele analysen ¹¹ og et tilstrækkeligt antal PBMC'er skal seedet. Kraftig pipettering, som kan forstyrre de adhærerede celler, bør undgås. En fremgangsmåde er altid at fjerne og tilføje løsninger fra samme hjørne af kammeret og til at sikre, at bevægelsen er langsom og stabil. Ligeledes under den sidste vask for at fjerne den overskydende RBC'er, bør bevægelsen være langsom og stabil. Dette sikrer minimal forstyrrelse af monolag, mens du stadig fjerne størstedelen af ​​de un-fagocyteret RBC. Utilstrækkelig vask vil føre til en høj baggrund af kontaminerende røde blodlegemer, hvilket gør manuel quantification vanskelig. For det andet skal de _{R2 R2} RBC'er være tilstrækkeligt opsoniseret at opnå en gennemsnitlig fagocytisk indeks på 80-120 for fagocytose kontrol. Dette ønskede fagocytisk rækkevidde en balance mellem den lethed optælling (f.eks monocytter med mere end 5 fagocyteret RBC er vanskeligt præcist at kvantificere) og opretholdelse af en passende mængde fagocytose til statistisk analyse. Graden af ​​opsonisering kan bekræftes ved en IAT, og en læsning mellem 3+ til 4+ er nødvendig. R ₂ R ₂ RBC skal kasseres, når der er overskydende lysis under vask, når supernatanten bliver mørk rød, eller når der observeres et signifikant fald i fagocytose i forsøg på grund af ældning af cellerne i opbevaring. Endelig kan manuel kvantificering ved hjælp af mikroskop være en vanskelig opgave, især når man sammenligner tæller mellem lab personale og mellem eksperimenter. Ved at undersøge det samme felt på hver brønd, eller blot ved at tælle flere cellerKan der opnås en mere ensartet tæller. Side-by-side træning med en erfaren tekniker og brugen af ​​en udpeget sæt af uddannelse dias anbefales.

En væsentlig kritik af MMA er subjektivitet manuel kvantificering trin. Men med tilstrækkelig uddannelse, konsistens kan opnås på tværs af forskellige tællere. En anden begrænsning er de iboende donor-til-donor forskelle i monocyt fagocytiske evne og i _{R2 R2} overfladeantigen ekspressionsniveauer, som er en kilde til variation data i forbindelse med behandlingen humane prøver.

Andre alternative teknikker er til rådighed for behandlingen FcyR-medieret fagocytose. Størstedelen af kommercielle kit udnytte fluorescerende output til at overvåge fagocytose (f.eks biopartikler, pH-sensitive fluorescerende protein eller IgG-mærkede fluorescerende latexkugler). Brugen af ​​fluorescerende output ikke tilbyde mere objektiv kvantificering, men man skal også at conSider tilgængeligheden, omkostninger og undervisning i forbindelse med brugen af ​​et fluorescensmikroskop eller et flowcytometer, samt den efterfølgende afhængighed af kommercielt tilgængelige kits.

Endelig kan dette assay modificeres afhængigt af den problemstilling. For eksempel, når narkotika testning hæmning af fagocytose, monocytter kan enten forbehandles eller co-inkuberes med både narkotika og opsoniseret RBC (dvs. en konkurrence assay). Den nedstrøms signalering af antistoffer af forskellige undertyper, kimære antistoffer eller rekombinante konstruktioner kan også testes. Med de seneste gennembrud i udviklingen af en universel antigen-null blod ^24, kunne MMA udnyttes i indledende skærme af disse antigen-null RBC med forskellige antistoffer til at vurdere, om der faktisk er en sænket effekt i at udløse fagocytose.

Materials

Acid citrate dextrose (ACD) vacutainers	BD	REF364606
RPMI 1640	Sigma	R8758
HEPES	Bioshop	HEP003.100
Fetal bovine serum	Multicell	080150
Gentamicin	Gibco	15710-64
Ficoll-Paque PLUS	GE	17-1440-03	https://www.gelifesciences.com/
Phosphate buffered saline	Sigma	D8537
8-chamber slides	Lab-Tek-ll	154534
R2R2 (cDE/cDE) red blood cells	Canadian Blood Services		Commercially available (e.g. http://www.bio-rad.com/en-ca/product/reagent-red-blood-cells)
Polyclonal anti-D from human serum	Gamma Biologics	DIN 02247724	Can be substituted with commercially available monoclonal anti-D or with Rh immune globulin
100% methanol	Caledon	6700-1-42
Polyvinyl alcohol resin	Sigma	P8136	Can be substituted with commercially available mount
UltraPure glycerine	Invitrogen	15514-011
Cover slips	VWR	48366 067
Novaclone anti-IgG	Immucorgamma	5461023	Optional for IAT (http://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/…/ucm081743.pdf)