Использование GFP-меченый TMEM184A Построить подтверждения гепарин Receptor идентичности
Summary
Кодирующий конструкцию TMEM184A с GFP меткой на карбокси-конце, предназначенной для экспрессии эукариотических, использовали в тестах, предназначенных для подтверждения идентификации TMEM184A как гепарин рецепторов в клетках сосудов.
Abstract
Когда новые белки идентифицированы путем изоляции и биоинформатики анализа аффинности на основе, они часто в значительной степени неизвестными свойствами. Антитела против специфических пептидов в пределах предсказанного последовательности позволяют некоторые эксперименты по локализации. Тем не менее, другие возможные взаимодействия с антителами, часто не могут быть исключены. Такая ситуация дала возможность разработать комплекс анализов в зависимости от последовательности белка. В частности, конструкция, содержащая последовательность гена, соединенную с кодирующей последовательностью GFP на С-конце белка, был получен и использован для этих целей. Эксперименты охарактеризовать локализацию, лиганд сродство, и усиление функции изначально были разработаны и проведены , чтобы подтвердить идентификацию TMEM184A как гепарин рецептора 1. Кроме того, конструкция может быть использована для проведения исследований, касающихся мембранных вопросов топологии и подробные белок-лиганд. В настоящем докладе А.Р.Анж экспериментальных протоколов, основанных на GFP-TMEM184A конструкции, выраженной в клетках сосудов, которые могут быть легко адаптированы для других новых белков.
Introduction
Идентификация белков-кандидатов для новых функций часто зависит от аффинности на основе протоколов изоляции с последующим определением частичной последовательности. Недавние примеры вновь выявленных белков включают трансмембранного белка 184А (TMEM184A), гепарин рецептор идентифицирован после того, как гепарин аффинных взаимодействий 1 и TgPH1 домен белка pleckstrin гомологии , который связывает фосфоинозитидного PI (3,5) P 2 2. Другие новые идентификации белков включает в себя прямой анализ последовательности пептидов , таких как , что с помощью Vit, и др. которые использовали трансмембранных пептидов для идентификации белковых продуктов из ранее охарактеризованных генов 3. Аналогичным образом , идентификация новых белковых последовательностей может быть осуществлено с использованием биоинформатики поиске ранее характеризуемых семейств белков , таких как идентификация новых белков 4TM 4. Изучение последовательностей генов аквапорин семьи имеет алтак дали идентификацию новых членов с новыми функциями 5. После идентификации, анализа функции белка, как правило, следующий шаг, который иногда может быть исследована с помощью специального анализа функции белка, таких как в случае аквапорин.
Когда это возможно, функция вновь идентифицированного белка могут быть изучены с специфической ферментативной или аналогичных функциональных анализов в лабораторных условиях . Поскольку многие функции новых белков зависят от сложных взаимодействий , которые происходят только в интактных клетках или организмов, в анализах пробирке не всегда эффективны. Тем не менее, in vivo на анализы должны быть сконструированы таким образом , что они зависят от последовательности гена. В культуре клеток и / или простых модельных организмов, нокдаун может предоставить подтверждающие доказательства для идентификации белка / функции 6. С помощью новых белков, идентифицированных как было отмечено выше, часто бывает недостаточно, чтобы просто сбить белок, чтобы подтвердить функцию, А.Н.d дизайн функциональных анализов in vivo на которые зависят от последовательности гена становится важным для характеристики новых белков.
Недавнее определение TMEM184A как рецептор гепарин (который модулирует пролиферацию в гладких мышцах сосудов и воспалительных реакций в эндотелиальных клетках) с использованием аффинной хроматографии и MALDI MS 1, 7 предоставляется возможность разработать набор анализов после нокдауна дали результаты , согласующиеся с идентификацией , Недавний обзор подтвердил , что гепарин специфически взаимодействует со многими факторами роста, их рецепторов, компонентов внеклеточного матрикса, рецепторы клеточной адгезии, а также другие белки 8. В сосудистой системе, гепарин и гепарансульфат протеогликанов (содержащий гепарансульфат цепи сходен по структуре с гепарином) взаимодействуют с несколькими сотнями белков 9. Для того, чтобы подтвердить, функционально ТНАт TMEM184A был связан с поглощением гепарин и переплета, были разработаны методы, которые использованы генную конструкцию для TMEM184A. Настоящий доклад включает в себя набор анализов на основе GFP-TMEM184A построить для использования в подтверждении идентичности TMEM184A как рецептор гепарином.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы , описанные здесь , были разработаны , чтобы предоставить подтверждающие доказательства для идентификации TMEM184A как гепарин рецепторов в клетках сосудов 1. Нокдаун методы, которые обычно используются в качестве механизма для подтверждения идентификации новых бе?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
References
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
- Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
- Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
- Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
- Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
- Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
- Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
- Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
- Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
- Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
- Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
- Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
- Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
- Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
- Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
- Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
