GFPタグTMEM184Aを使用すると、ヘパリン受容体のアイデンティティの確認のために構築します
Summary
真核生物の発現のために設計されたカルボキシ末端にGFPタグを有する構築物をコードするTMEM184Aは、血管細胞中のヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定を確認するために設計されたアッセイに使用しました。
Abstract
新規タンパク質は、親和性に基づく分離やバイオインフォマティクス解析によって識別されると、彼らはしばしば、主に特徴付けられていないです。予測される配列内の特定のペプチドに対する抗体は、いくつかのローカライズ実験を可能にします。しかし、抗体と他の可能な相互作用は、多くの場合、除外することはできません。この状況は、タンパク質配列に依存するアッセイのセットを開発する機会を提供しました。具体的には、タンパク質のC末端にGFPコード配列に連結された遺伝子配列を含む構築物が得られ、これらの目的のために使用しました。局在化、リガンド親和性、および機能の利得を特徴付けるための実験は、最初に設計し、ヘパリン受容体1としてTMEM184Aの同定を確認するために行きました。さらに、構築物は膜トポロジーの問題に取り組む研究および詳細なタンパク質 – リガンド相互作用のために使用することができます。本報告書は、ARを提示します簡単に他の新規タンパク質のために適合させることができる血管細胞で発現したGFP-TMEM184A構築に基づいて実験プロトコルのアンジュ。
Introduction
新規な機能のための候補タンパク質の同定は、多くの場合、部分配列決意が続く親和性に基づく分離プロトコルに依存します。新たに同定されたタンパク質の最近の例は、膜貫通タンパク質184A（TMEM184A）、ヘパリン親和性相互作用1後に同定ヘパリン受容体、およびTgPH1、ホスホイノシチドPI（3,5）P 2 2を特異的に結合するプレクストリン相同ドメインタンパク質が含まれます。その他の新規タンパク質の同定は、このような、 らビタミンによって、そのようなペプチドの直接配列分析を必要とします。人は、以前に特徴付けられていない遺伝子3からタンパク質産物を識別するために、膜貫通ペプチドを使用していました。同様に、新規のタンパク質配列の同定は、このような新しい4TMタンパク質4の識別として以前に特徴付けられるタンパク質ファミリーの探索バイオインフォマティクスを用いて達成することができます。アクアポリンファミリー遺伝子配列の検査は、Alを有しますそのように新しい機能5と新メンバーの同定をもたらしました。識別後、タンパク質機能の解析は、しばしば、このようなアクアポリンの場合のように、タンパク質機能の特異的なアッセイを用いて試験することができる次のステップは、典型的には。
可能な場合は、新たに同定されたタンパク質の機能は、特定の酵素または類似のインビトロ機能アッセイを用いて調べることができます。新規タンパク質の多くの機能が唯一無傷の細胞または生物で発生する複雑な相互作用に依存しているため、in vitroアッセイは、必ずしも有効ではありません。しかし、 インビボアッセイは、それらが遺伝子配列に依存するように設計されなければなりません。細胞培養、および/または単純なモデル生物では、ノックダウンは、タンパク質/機能同定6のための証拠を提供することができます。上記のように同定された新規のタンパク質と、単に機能を確認するために、タンパク質をノックダウンすることがしばしば不十分です、D遺伝子配列に依存してin vivoでの機能アッセイの設計は、新規タンパク質の特徴付けのために重要になります。
ノックダウンは、識別と一致する結果が得られた後、ヘパリンレセプターとしてTMEM184Aの最近の同定は、アフィニティークロマトグラフィーおよびMALDI MS 1を使用して（すなわち、血管平滑筋および内皮細胞における炎症応答において増殖を調節する）、7は、アッセイのコレクションを開発する機会を提供し。最近のレビューは、ヘパリンは、多くの増殖因子、それらの受容体、細胞外マトリックス成分、細胞接着受容体、および他のタンパク質8と特異的に相互作用することが確認されました。血管系では、ヘパリンおよびヘパラン硫酸プロテオグリカン（ヘパリンと同様の構造でヘパラン硫酸鎖を含む）は、数百のタンパク質9と相互作用します。機能的に股関節を確認するために、トンTMEM184Aはヘパリンの取り込みと結合に関与していた、TMEM184Aための遺伝子構築物を使用される技術が開発されました。本レポートでは、GFP-TMEM184Aに基づくアッセイのコレクションはヘパリン受容体としてTMEM184Aの身元を確認するのに使用するための構築物が含まれます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで報告されたプロトコルは、血管細胞1におけるヘパリン受容体としてTMEM184Aの同定のための確証的な証拠を提供するように設計されました。ノックダウン技術は、日常的に、新規なタンパク質の同定を確認するための1つのメカニズムとして使用されます。しかし、ノックダウン後のいくつかの機能の損失は、典型的には、候補タンパク質が実際に正しい受容体（または…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research in the Lowe-Krentz lab is supported by research grant HL54269 from the National Institutes of Health to LLK.
Materials
| GFP-TMEM184A construct | OriGene | RG213192 | |
| Rhodamine-Heparin | Creative PEGWorks | HP-204 | Light Sensitive |
| Fluorescein-Heparin | Creative PEGWorks | HP-201 | Light Sensitive |
| Mowiol | EMD Millipore | 475904-100GM | |
| Paraformaldehyde (methanol free) | Thermo Sci Pierce Biotech, available through Fisher Scientific | PI28908 at Fisher | Use in Fume Hood |
| Reacti-bind neutravidin plates (Avidin coated black 96 well dishes) | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | PI15510 at Fisher | Pay attention to shelf-life |
| Black 96 well plates | Corning Life Sciences Plastic, purchased through Fisher Scientific | 064432 at Fisher | |
| A7r5 vascular smooth muscle cell line | ATCC | CRL 1444 | Can be exchanged into MEM medium1 |
| BAOEC bovine aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | B304-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1,7 |
| BAOSMC bovine aortic smooth muscle cells | Cell Applications, Inc. | B354-05 | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture1 |
| RAOEC rat aortic endothelial cells | Cell Applications, Inc. | R304-05a | Culture as recommended initially, can be exchanged into MEM medium for continuing culture7 |
| Biotinylated anti-GFP | Thermo Sci Pierce Biotech, through Fisher Scientific | MA5-15256-BTIN | |
| Streptavidin-coated beads | Sigma | S1638 | |
| HeBS | Available from Bio-Rad | Can be prepared in the lab. The pH is 6.8 | |
| TMEM184A antibody to the N-terminus | Santa Cruz Biotechnology | sc292006 | Only known TMEM184A antibody to N-terminal region. |
| TMEM184A antibody to the C-terminus | Obtained from ProSci Inc, Poway, CA | Pro Sci 5681 | ProSci used in figure 1 |
| GFP antibodies | Santa Cruz Biotechnology | sc9996 | Used in figures 5 |
| Secondary antibodies, labeled with TRITC or Cy3 | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc, West Grove, PA | 711 025 152 (donkey anti-rabbit, TRITC) 715 165 150 (donkey anti-mouse, Cy3) |
Minimal cross-reactivity to minimize any non-specific staining. |
| CHAPS | Purchased from Sigma | C5849 | Note that this specific catalog number has been discontinued. Supplier will provide information regarding replacement. |
| Live imaging 35 mm dishes | MatTek (Ashland MA) | P35G-1.0 – 20 mm – C | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 Meta with a 63X oil-immersion lens | Used for images and live-imaging in Figures 1, 2 and 3 |
| Confocal Microscope | Nikon | C2+ confocal with a 60X oil-immersion lens | Used for images in Figure 5 |
| Confocal Microscope | Zeiss | Zeiss LSM 880 with a 63X oil-immersion lens | Used for images in Figure 2C |
| Electroporation equipment | Bio-Rad | Gene Pulser X-Cell System | |
| Electroporation cuvettes | Available from MidSci | EC2L | Can also be obtained from equipment supplier |
| Plate reader | TECAN | TECAN Infinite® m200 Pro plate reader | Readings in the middle of the wells rather than at the surface. |
| Computer program for measuring staining intensity | Image J | https://imagej.nih.gov/ij/ Program and information available on-line |
Any appropriate program can be used. See https://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html for additional detail |
| Cell Culture trypsin solution | Sigma | T4174 | purchased as a 10X solution |
References
- Pugh, R. J., et al. Transmembrane Protein 184A Is a Receptor Required for Vascular Smooth Muscle Cell Responses to Heparin. J Biol Chem. 291, 5326-5341 (2016).
- Daher, W., et al. Identification of Toxoplasma TgPH1, a pleckstrin homology domain-containing protein that binds to the phosphoinositide PI(3,5)P. Mol Biochem Parasitol. , (2016).
- Vit, O., et al. Large-scale identification of membrane proteins based on analysis of trypsin-protected transmembrane segments. J Proteomics. , (2016).
- Attwood, M. M., et al. Topology based identification and comprehensive classification of four-transmembrane helix containing proteins (4TMs) in the human genome. BMC genomics. 17, 268 (2016).
- Zou, Z., et al. Genome-Wide Identification of Jatropha curcas Aquaporin Genes and the Comparative Analysis Provides Insights into the Gene Family Expansion and Evolution in Hevea brasiliensis. Front Plant Sci. 7, 395 (2016).
- Gilotti, A. C., et al. Heparin responses in vascular smooth muscle cells involve cGMP-dependent protein kinase (PKG). J Cell Physiol. 229, 2142-2152 (2014).
- Farwell, S. L., et al. Heparin Decreases in Tumor Necrosis Factor alpha (TNFalpha)-induced Endothelial Stress Responses Require Transmembrane Protein 184A and Induction of Dual Specificity Phosphatase 1. J Biol Chem. 291, 5342-5354 (2016).
- Xu, D., Esko, J. D. Demystifying heparan sulfate-protein interactions. Annu Rev Biochem. 83, 129-157 (2014).
- Chiodelli, P., Bugatti, A., Urbinati, C., Rusnati, M. Heparin/Heparan sulfate proteoglycans glycomic interactome in angiogenesis: biological implications and therapeutical use. Molecules. 20, 6342-6388 (2015).
- Slee, J. B., Lowe-Krentz, L. J. Actin realignment and cofilin regulation are essential for barrier integrity during shear stress. J Cell Biochem. 114, 782-795 (2013).
- Patton, W. A., et al. Identification of a heparin-binding protein using monoclonal antibodies that block heparin binding to porcine aortic endothelial cells. The Biochemical journal. 311, 461-469 (1995).
- Doggett, T. M., Breslin, J. W. Study of the actin cytoskeleton in live endothelial cells expressing GFP-actin. J Vis Exp. , (2011).
- Skalamera, D., et al. Generation of a genome scale lentiviral vector library for EF1alpha promoter-driven expression of human ORFs and identification of human genes affecting viral titer. PloS one. 7, 51733 (2012).
- Castro, M., Nikolaev, V. O., Palm, D., Lohse, M. J., Vilardaga, J. P. Turn-on switch in parathyroid hormone receptor by a two-step parathyroid hormone binding mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 16084-16089 (2005).
- Albertazzi, L., Arosio, D., Marchetti, L., Ricci, F., Beltram, F. Quantitative FRET analysis with the EGFP-mCherry fluorescent protein pair. Photochem Photobiol. 85, 287-297 (2009).
- Wang, S., et al. Domain organization of the ATP-sensitive potassium channel complex examined by fluorescence resonance energy transfer. J Biol Chem. 288, 4378-4388 (2013).
- Christiansen, E., Hudson, B. D., Hansen, A. H., Milligan, G., Ulven, T. Development and Characterization of a Potent Free Fatty Acid Receptor 1 (FFA1) Fluorescent Tracer. J Med Chem. 59, 4849-4858 (2016).
- Chiang, C. F., Okou, D. T., Griffin, T. B., Verret, C. R., Green Williams, M. N. fluorescent protein rendered susceptible to proteolysis: positions for protease-sensitive insertions. Arch Biochem Biophys. 394, 229-235 (2001).
