Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.
Frigivelsen af ekstracellulære vesikler (EVS), herunder små endosomale-afledte exosomer (Exos, diameter <100 nm) og store plasma membran-afledte mikrovesikler (MVS diameter> 100 nm) er en grundlæggende cellulær proces, der forekommer i alle levende celler. Disse vesikler transportproteiner, lipider og nukleinsyrer specifikke for deres celle af oprindelse og in vitro-undersøgelser har fremhævet deres betydning som formidlere af intercellulære kommunikation. Elbiler succes er blevet isoleret fra forskellige legemsvæsker og især elbiler i blod er blevet identificeret som lovende biomarkører for cancer eller infektionssygdomme. For at muliggøre studiet af MV subpopulationer i blod, præsenterer vi en protokol for standardiseret isolering og karakterisering af MV'er fra perifere blodprøver. MV'er pelleteres fra EDTA-antikoaguleret plasmaprøver ved differentiel centrifugering og har typisk en diameter på 100 – 600 nm. På grund af deres større størrelse, kan delet undersøges ved flowcytometri, en teknik, der rutinemæssigt anvendes i klinisk diagnostik og tilgængelig i de fleste laboratorier. Flere eksempler til kvalitetskontrol assays af de isolerede MV'er vil blive givet, og markører, der kan anvendes til skelnen mellem forskellige subpopulationer MV i blod vil blive præsenteret.
I de sidste år har mange in vitro-undersøgelser har vist, at ekstracellulære vesikler (elbiler) spiller en vigtig rolle i intercellulær kommunikation. Levende celler konstant kaste vesikler, der adskiller sig i størrelse, indhold og biogenese. De bedst undersøgte elbiler er exosomer, der stammer fra den endosomale system, hvor de lagres som intraluminale vesikler i multivesikulære organer. Når sidstnævnte sikring med plasmamembranen, er de indeholdte vesikler udgivet som exosomer (Exos, diameter 30 – 100 nm 1). En anden population af EV, der har fået stigende opmærksomhed i de seneste år er store mikrovesikler (MVS diameter 100 – 1000 nm), som knop off direkte fra plasmamembranen 2.
Begge typer af vesikler omgivet af et lipiddobbeltlag og indeholder nukleinsyrer, fx DNA, mRNA eller miRNA 3 – 5, og et væld af proteiner, som de kan overføre til tilstødende Calen. Generelt har proteinsammensætningen af vesiklerne afspejler tilstanden af cellen for oprindelse, synes nogle proteiner selektivt at blive målrettet og beriget på elbiler 1. En stor forskning interesse er at karakterisere elbiler fra unormale og syge celler med henblik på at definere specifikke EV signaturer, som kan tillade brugen af elbiler som nye biomarkører. Især i cancer, som ofte tumoren selv er ikke let tilgængelig, kan flydende biopsier målrettet tumorspecifikke elbiler i blod tillade overvågning af terapi responser eller hjælpe karakteriserer den primære tumor uden behov for invasive procedurer 6.
Faktisk elbiler er allerede blevet isoleret fra forskellige kropsvæsker, herunder urin 7, CSF 8, modermælk 9 eller blod 10. Flere undersøgelser identificeret ændringer i EV tæller og sammensætning i forskellige humane sygdomme. For eksempel i sepsispatienter antallet af pro-koagulerende MV'er ersteget betydeligt i forhold til raske personer 11. Også hos patienter med svær cerebral malaria kan observeres en stigning i de samlede MV'er i blod og tællinger af blodpladeafledte MV'er korrelerer med koma dybde og trombocytopeni 12. Andre undersøgelser rapporterer forhøjede antal endotelafledt vesikler i patienter med systemisk lupus erythematosus eller hjertesvigt og i tilfælde af sidstnævnte, dette korrelerer med en højere sandsynlighed for kardiovaskulære hændelser 13,14.
Især i kræft, er elbiler i blod i øjeblikket drøftes som nye biomarkører med diagnostisk og prognostisk værdi. Niveauer af MV'er udtrykker tumorassocierede proteiner, såsom MUC1, EGFR eller FAK synes at være forhøjet i blodet hos brystcancerpatienter 15,16. Også for Exos, de seneste undersøgelser har vist, at blod-afledte Exos bærer tumor antigener, såsom glypican-1 for kræft i bugspytkirtlen eller Del-1 for brystkræft tillade tidlig sygdom debeskyttelse med høj specificitet og følsomhed 17,18. Endvidere kan serum-afledte tumor Exos indeholde DNA, som kan anvendes til påvisning af mutationer, såsom KRAS og p53 som foreslår deres anvendelse til terapi forudsigelse 19. Nylige fremskridt har vist, at analysen af Exos i blod af glioblastom patienter ved hjælp af en specifik mikrofluid chip tillader overvågning af behandlingen 20. Tilsammen disse resultater indebærer, at analysen af sygdomsspecifikke subpopulationer af vesikler giver værdifulde oplysninger om diagnose, prognose samt terapeutiske muligheder og succes.
Imidlertid isolering og analyse af Exos fra blod er tidskrævende, kræver særlig lab udstyr og er derfor endnu ikke egnet til rutinemæssig klinisk diagnosticering. I modsætning hertil kan MV'er isoleres meget hurtigere og, på grund af deres større størrelse, kan let analyseres ved flowcytometri uden behov for at koble dem til latexperler, som det er nødvendigt for Exos 18, 21. Således her præsenterer vi en protokol, som kan anvendes til den standardiserede isolering af MV'er fra blodprøver og den efterfølgende karakterisering af MV subpopulationer ved flowcytometri. Denne protokol vil gøre det muligt for yderligere undersøgelse og i dybden karakterisering af MV profiler i store patientgrupper som vil være nødvendige for at kunne bruge MV'er til dagligdags klinisk diagnostik.
Nylige undersøgelser af elbiler i blodet har vist, at EV sammensætning og tæller ændrer sig under årsagen til flere sygdomme. Derfor er analyse og yderligere karakterisering af disse elbiler er af stor interesse for yderligere at vurdere deres potentielle anvendelse som sygdom biomarkører for diagnose og prognose eller evaluere terapi svar. Protokollen præsenterer vi her tillader isoleringen af vesikler med en diameter på op til 600 nm, som ikke indeholder celleorganeller. Disse observationer er i overensstemmelse med den nuværende definition af MV'er og udelukke tilstedeværelsen af apoptotiske legemer 2. Ved hjælp af Western blot, var vi i stand til at vise, at de isolerede MV'er viser en høj ekspression af tubulin, mens tetraspanins CD9 og CD81, der ofte bruges som Exo markører blev kun lidt til udtryk. Dette bekræfter, at MV'er adskiller sig fra Exos og passer til de seneste dybdegående karakterisering og sammenligning af de to EV befolkninger ved proteomics 25.
indhold "> Under erhvervelsen af blodprøver, er det vigtigt at holde tiden mellem venepunktur og plasma forberedelse så kort som muligt for at forhindre MV nedbrydning. Desuden kunne forlænget opbevaring af blodprøver føre til aktivering af blodlegemer forårsager forøget MV kaste og i sidste ende apoptose, som resulterer i frigivelsen af apoptotiske legemer. En anden vigtig overvejelse for MV isolation er at forhindre kontaminering af MV præparater med plasmaproteiner eller mindre Exos. Derfor er det vigtigt at fjerne så meget af supernatanten som muligt efter nedspinning MVS ved 14.000 x g. Da pelleten er normalt synlige og stramt fastgjort til væggen af røret, supernatanten kan let fjernes med en pipettespids. i modsætning til Exos som har tendens til at danne aggregater under fremstillingen af højhastigheds-ultracentrifugering og er ofte svært at resuspendere, er dette problem ikke opstå med MV'er.Vores undersøgelse viser, at det er muble at karakterisere MV subpopulationer stede i blod ved flowcytometri. Selv detektionsgrænsen for de fleste flowcytometre er ca. 200 – 300 nm, blev MV'er reproducerbart målt i donoren samt cellekultur prøver med de samme parametre for analyse og porte, der klart er tilladt deres skelnen fra baggrundssignaler. Det er vigtigt at kontrollere før målingerne, at PBS er anvendt til analyse indeholder ingen forurenende partikler, der kan forårsage en høj baggrund i flowcytometri (figur 3). Selvom nogle mindre MV'er ikke vil blive fanget i en flowcytometrisk tilgang, vi har registreret MV'er fra alle større blod cellepopulationer (f.eks blodplader, røde blodlegemer, leukocytter, endotelceller). I vores analyser brugte vi standard markører for de forskellige blodlegemer, der tidligere er blevet fundet på MV'er 26 – 29. Det skal bemærkes, at for at opnå de bedst mulige resultater ved flowcytometri, than mængde og koncentration af alle antistoffer skal titreres på en MV prøve udtrykker antigenet af interesse. Hvis specifikke MV subpopulationer i blod skal identificeres med højere specificitet, er det muligt at udføre dobbelt farvning mod to forskellige antigener til stede på de respektive MV'er og kun overveje alle dobbelt positive MV'er til efterfølgende analyser 23. I øjeblikket er der bestræbelser på at fastlægge en standard sortiment af MV subpopulationer i blod fra raske individer 23,30. Disse undersøgelser har allerede vist, at blodpladeafledte MV'er udgør den største bestand af MV'er i blod, som er i overensstemmelse med vores observationer.
En fordel ved flowcytometri at karakterisere MV prøver er, at denne metode allerede er veletableret til diagnostiske formål i de fleste kliniske centre, som ville give den mulige brug af MV'er som biomarkører i daglig klinisk diagnostik. Tidligere undersøgelser af elbiler i blod, som har det meste fokused på mindre Exos, stole på enten specifikke sortering procedurer til selektivt analysere ønskede Exo målgruppen 31,32 eller kræve en tidskrævende (2 dage) isolation proces med kobling af Exos for latex perler før analyse 18. Vore egne upublicerede observationer antyder, at den flowcytometrisk analyse af MV'er fra fuldblodspræparationer selv muliggør påvisning af MV'er såsom tumorafledte MV'er uden en sådan udvælgelsesproces.
Tilsammen protokollen præsenteres her muliggør hurtig isolering af MV'er fra perifere blodprøver med standard laboratorieudstyr og deres efterfølgende karakterisering ved anvendelse af flowcytometri og vestlige Blotting. Hele processen kan udføres i omkring 2 timer, som vil lette kommende undersøgelser af MV profiler i patienternes blod, der er nødvendige for at vurdere potentialet i MV'er som sygdom biomarkører.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).
butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5µl for staining |
CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5µl for staining |
CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8µg for staining |
CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1µg for staining |
CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56°C) |
filter 0.22µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5000 in 5%BSA in TBST |
ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 |