Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.
Utgivelsen av ekstracellulære vesikler (EVS) inkludert små endosomal-avledet exosomes (Exos, diameter <100 nm) og store plasmamembran avledet mikrovesikler (MVS diameter> 100 nm) er en grunnleggende cellulær prosess som skjer i alle levende celler. Disse blemmer transportproteiner, lipider og nukleinsyrer spesifikke for sin celle opprinnelsesland og in vitro studier har markert sin betydning som formidlere av interkommunikasjon. Elbiler har blitt isolert fra ulike kroppsvæsker og spesielt elbiler i blodet har blitt identifisert som lovende biomarkører for kreft eller infeksjonssykdommer. For å muliggjøre studier av MV subpopulasjoner i blod, presenterer vi en protokoll for det standardiserte isolering og karakterisering av MV fra perifere blodprøver. MV pelleteres fra EDTA-antikoagulert plasmaprøver ved differensialsentrifugering og har typisk en diameter på 100 – 600 nm. På grunn av deres større størrelse, kan delett bli studert ved flowcytometri, en teknikk som blir rutinemessig brukt i klinisk diagnostikk og tilgjengelig i de fleste laboratorier. Flere eksempler for kvalitetskontroll analyser av de isolerte MV vil bli gitt, og markører som kan brukes for diskriminering av forskjellige MV subpopulasjoner i blod vil bli presentert.
I de siste årene har mange in vitro-studier har vist at ekstracellulære vesikler (EV) spiller en viktig rolle ved intercellulær kommunikasjon. Levende celler stadig kaster vesikler som varierer i størrelse, innhold og biogenesis. De beste studerte elbiler er exosomes som stammer fra endosomal system hvor de er lagret som intraluminale vesikler i muitivesikulære organer. Når den sistnevnte sikring med plasmamembranen, er inneholdt vesiklene frigjøres som exosomes (Exos, diameter 30-100 nm 1). En annen populasjon av EV som har fått økende oppmerksomhet i de siste årene er store mikrovesikler (MVS diameter 100 – 1000 nm) som knopp av direkte fra plasmamembranen to.
Begge typer av vesikler er omgitt av et lipidbilag og inneholder nukleinsyrer, for eksempel, DNA, mRNA eller miRNA 3 – 5, og en mengde av proteiner som de kan overføre til nabo calen. Mens generelt proteinsammensetningen av vesiklene reflekterer tilstanden av cellen ifølge opprinnelsen, noen proteiner synes å være selektivt målrettet og anriket på elbil 1. En stor forskningsinteresse er å karakter elbiler fra unormale og syke celler for å definere bestemte EV signaturer som kan tillate bruk av elbiler som nye biomarkører. Spesielt i kreft, i hvilket ofte selve tumoren ikke er lett tilgjengelig, kan det flytende biopsier målrettet mot tumorspesifikt EV i blod tillate overvåking av terapi responser eller hjelpe til å karakterisere den primære svulsten uten behov for invasive prosedyrer 6.
Faktisk elbiler har allerede blitt isolert fra ulike kroppsvæsker inkludert urin 7, CSF 8, morsmelk 9 eller blod 10. Flere studier identifisert endringer i EV teller og sammensetning i ulike menneskelige sykdommer. For eksempel, i sepsis pasienter antall pro-koagulerende MV erbetydelig økt sammenlignet med friske individer 11. Også hos pasienter med alvorlig cerebral malaria kan observeres en økning i totale MV i blod og tellinger av plate avledet MV korrelerer med koma dybde og trombocytopeni 12. Andre studier rapporterer forhøyede antall av endotel-avledede vesikler hos pasienter med systemisk lupus erythematosus eller hjertesvikt og i tilfelle av sistnevnte, dette korrelerer med en høyere sannsynlighet av kardiovaskulære hendelser 13,14.
Spesielt i kreft, er elbiler i blodet for tiden diskutert som nye biomarkører med diagnostisk og prognostisk verdi. Nivåer av MV som uttrykker tumor-assosierte proteiner som MUC1, EGFR eller FAK synes å være forhøyet i blodet hos brystkreftpasienter 15,16. Også for Exos Nyere studier har vist at blodavledede Exos bærer tumorspesifikke antigener slik som Glypican-1 for kreft i bukspyttkjertelen eller Del-1 for brystkreft tillate tidlig sykdom debeskyttelse med høy spesifisitet og sensitivitet 17,18. I tillegg kan serum-avledet tumor Exos inneholde DNA som kan anvendes for påvisning av mutasjoner som KRAS og p53 som antyder deres anvendelse for terapi forutsigelse 19. Nylige fremskritt har vist at analyse av Exos i blodet hos pasienter med glioblastom bruke en bestemt microfluidic chip tillater kontroll av behandlingen 20. Samlet utgjør disse funnene antyder at analyse av sykdomsspesifikke subpopulasjoner av vesikler gir verdifull informasjon om diagnose, prognose samt behandlingsalternativer og suksess.
Men isolering og analyse av Exos fra blod er tidkrevende, krever spesiell lab utstyr og derfor er ennå ikke egnet for rutinemessig klinisk diagnostikk. I motsetning til dette, kan MV isoleres mye raskere og, på grunn av sin større størrelse, kan lett bli analysert ved strømningscytometri uten behov for å koble dem til lateksperler som det er nødvendig for Exos 18, 21. Således, her presenterer vi en protokoll som kan anvendes for den standardiserte isolering av MV fra blodprøver, og den påfølgende karakterisering av MV subpopulasjoner ved strømningscytometri. Denne protokollen vil tillate videre studier og i inngående karakterisering av MV profiler i store pasientgrupper som vil være nødvendig for å kunne bruke MV for daglige kliniske diagnostikk.
Nyere studier på elbiler i blodet har vist at EV sammensetning og teller endres i løpet av årsaken til flere sykdommer. Derfor analysen og videre karakterisering av disse elbiler er av høy interesse for å vurdere ytterligere deres potensielle bruk som sykdoms biomarkører for diagnose og prognose eller å evaluere terapi svar. Protokollen vi presenterer her tillater isolering av vesikler med en diameter på opp til 600 nm, som ikke inneholder noen celleorganeller. Disse observasjonene er i linje med den nåværende definisjonen av MV og utelukke tilstedeværelse av apoptotiske legemer 2. Ved hjelp av Western blotting, var vi i stand til å vise at de isolerte MV viser en høy uttrykk for Tubulin, mens tetraspanins CD9 og CD81 som ofte brukes som Exo markører ble bare litt uttrykt. Dette bekrefter at MV avvike fra Exos og passer til nyere grundig karakterisering og sammenligning av begge EV populasjoner av proteomikk 25.
innhold "> Under anskaffelse av blodprøver, er det avgjørende å holde tiden mellom venepunkteringen og plasma-fremstilling så kort som mulig for å forhindre MV nedbryting. Videre kan forlenget lagring av blodprøver fører til aktivering av blodceller som forårsaker forbedret MV shedding og til slutt apoptose som resulterer i frigjøring av apoptotiske legemer. en annen viktig faktor for MV isolasjon er å hindre forurensing av MV preparater med plasmaproteiner eller mindre Exos. Derfor er det viktig å fjerne så mye av supernatanten som mulig etter å spinne ned MVS ved 14000 x g. etter pelleten normalt er synlig og tett festet til veggen av røret, supernatanten kan lett fjernes med en pipettespiss. i motsetning til Exos som har en tendens til å danne aggregater under fremstilling ved høy hastighet ultrasentrifugering og er ofte vanskelig å suspendere, betyr dette problemet oppstår ikke med MV.Vår studie viser at det er imidleold til å karakterisere MV subpopulasjoner som er tilstede i blodet ved flowcytometri. Selv om påvisningsgrensen for de fleste flowcytometere er omkring 200-300 nm, ble MV reproduserbart målt i donor, så vel som cellekulturprøver med de samme parametre for analyse og porter som klart er tillatt deres forskjell fra bakgrunnssignaler. Det er viktig å kontrollere før målingene som PBS benyttet for analysen ikke inneholder forurensende partikler som kan føre til en høy bakgrunn ved flowcytometri (figur 3). Selv om noen mindre MV ikke kan bli fanget i en flowcytometrisk tilnærming, vi har oppdaget MV fra alle de store blodcellepopulasjoner (f.eks blodplater, røde blodceller, leukocytter, endotelceller). I våre analyser vi brukte standardmarkører for de forskjellige blodceller som er blitt funnet på MV 26 – 29. Det skal bemerkes at for å oppnå de best mulige resultater ved flowcytometri, than mengden og konsentrasjonen av alle antistoffer bør titreres på en MV prøve som uttrykker antigenet av interesse. Hvis MV spesifikke subpopulasjoner i blodet skal identifiseres med høyere spesifisitet, er det mulig å utføre dobbelt-farging mot to forskjellige antigener til stede på de respektive MV og bare ta hensyn til alle dobbelt positive MV for etterfølgende analyser 23. For tiden er det arbeidet med å definere et standard utvalg av MV subpopulasjoner i blodet hos friske individer 23,30. Disse studiene har allerede vist at plate avledet MV utgjør den største bestanden av MV i blodet som er i samsvar med våre observasjoner.
En fordel med flowcytometri for å karakterisere MV prøvene er at denne metoden er allerede godt etablert for diagnostiske formål i de fleste kliniske sentre som ville tillate mulig bruk av MV som biomarkører i hverdags klinisk diagnostikk. Tidligere studier på elbiler i blodet som har mest fokused på mindre Exos, er avhengige av enten spesifikke sorterings prosedyrer for å selektivt analysere ønsket Exo målgruppen 31,32 eller krever en tidkrevende (2 dager) isolasjon prosessen med kobling av Exos mot lateks perler før analyse 18. Våre egne upubliserte observasjoner tyder på at den flowcytometrisk analyse av MV fra fullblods forberedelser gjør at selv påvisning av MV som tumor-avledet MV uten slike utvelgelsesprosesser.
Til sammen protokollen presenteres her muliggjør rask isolering av MV fra perifere blodprøver med standard laboratorieutstyr og deres påfølgende karakterisering ved hjelp av flowcytometri og Western blotting. Hele prosessen kan utføres i rundt to timer som vil legge til rette for fremtidige studier på MV profiler i pasientenes blod som er nødvendige for å vurdere potensialet for MV som sykdoms biomarkører.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).
butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5µl for staining |
CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5µl for staining |
CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8µg for staining |
CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1µg for staining |
CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56°C) |
filter 0.22µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5000 in 5%BSA in TBST |
ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 |