Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.
Frisläppandet av extracellulära vesiklar (EVS) inklusive små endosomala härrörande exosomes (Exos, diameter <100 nm) och stora plasmamembran härledda mikrovesiklar (MV, diameter> 100 nm) är en grundläggande cellulär process som sker i alla levande celler. Dessa vesiklar transportproteiner, lipider och nukleinsyror som är specifika för deras cell ursprungsland och in vitro studier har visat sin betydelse som förmedlare av intercellulär kommunikation. Elbilar har framgångsrikt isolerats från olika kroppsvätskor och särskilt elfordon i blod har identifierats som lovande biomarkörer för cancer eller infektionssjukdomar. I syfte att möjliggöra studier av MV subpopulationer i blod, presenterar vi ett protokoll för den standardiserade isolering och karakterisering av MV från perifera blodprover. MV pelleteras från EDTA-antikoagulerat plasmaprover från differentiell centrifugering och vanligtvis har en diameter på 100 – 600 nm. På grund av deras större storlek, kan delätt att studeras med flödescytometri, en teknik som rutinmässigt används i klinisk diagnostik och tillgängliga i de flesta laboratorier. Flera exempel för kvalitetskontroll analyser av de isolerade MV ges och markörer som kan användas för diskriminering av olika MV subpopulationer i blod kommer att presenteras.
Under de senaste åren har många in vitro studier har visat att extracellulära vesiklar (EVS) spelar en viktig roll i kommunikationen mellan. Levande celler skjul ständigt vesiklar som skiljer sig i storlek, innehåll och biogenes. De mest studerade elbilar är exosomes som härrör från det endosomala system där de lagras som intraluminala blåsor i multivesikulära kroppar. När den senare säkring med plasmamembranet, är de inneslutna blåsor utsläppt som exosomes (Exos, diameter 30-100 nm 1). En andra population av EV som har fått allt större uppmärksamhet under de senaste åren är stora mikrovesiklar (MV, diameter 100 – 1000 nm), vilka knoppas av direkt från plasmamembranet 2.
Båda typerna av vesiklar är omgivna av ett lipiddubbelskikt och innehåller nukleinsyror, t.ex. DNA, mRNA eller miRNA 3-5, och en uppsjö av proteiner som de kan överföra till angränsande calnar. Även i allmänhet proteinsammansättningen av vesiklar speglar tillståndet i cellen ursprungs vissa proteiner verkar vara selektivt riktad och berikas på elfordon 1. Ett stort forskningsintresse är att karakterisera elfordon från onormala och sjuka celler för att definiera specifika EV signaturer som kan tillåta användning av elbilar som nya biomarkörer. Särskilt i cancer, där ofta själva tumören är inte lättillgänglig, kan flytande biopsier riktar tumörspecifika elbilar i blod möjliggöra övervakning av terapisvar eller hjälp att karakterisera den primära tumören utan att invasiva procedurer 6.
Faktum är att elbilar har redan framgångsrikt isolerats från olika kroppsvätskor, inklusive urin 7 CSF 8, bröstmjölk 9 eller blod 10. Flera studier identifierade förändringar i EV räknas och sammansättning i olika mänskliga sjukdomar. Till exempel, i sepsispatienter antalet pro-koagulerande MV ärsignifikant ökad jämfört med friska individer 11. Även hos patienter med svår cerebral malaria en ökning av den totala MV i blod kan observeras och räkningar av blodplätthärledda MV korrelerar med koma djup och trombocytopeni 12. Andra studier rapporterar ökat antal endotelhärledd vesiklar hos patienter med systemisk lupus erythematosus eller hjärtsvikt och när det gäller det senare, detta korrelerar med en högre sannolikhet för kardiovaskulära händelser 13,14.
Särskilt i cancer, är elbilar i blod för närvarande diskuteras som biomarkörer med diagnostiska och prognostiska värde. Nivåer MV som uttrycker tumörassocierade proteiner såsom MUC1, EGFR eller FAK verkar vara förhöjda i blodet hos bröstcancerpatienter 15,16. Även för Exos har nya studier visat att blodbaserade Exos bär tumörspecifika antigener såsom Glypican-1 för pankreascancer eller Del-1 för bröstcancer möjliggöra tidig sjukdom deskydd med hög specificitet och sensitivitet 17,18. Dessutom kan serum härlett tumör Exos innehålla DNA, som kan användas för detektion av mutationer, såsom KRAS och p53 vilket antyder deras användning för terapi prediktion 19. Nya framsteg har visat att analys av Exos i blodet hos glioblastom patienter som använder en specifik mikroflödes chip tillåter övervakning av terapi 20. Sammantaget dessa fynd tyder på att analys av sjukdomsspecifika subpopulationer av vesiklar ger värdefull information om diagnos, prognos samt behandlingsalternativ och framgång.
Emellertid är isolering och analys av Exos från blod tidsödande, kräver speciell laboratorieutrustning och därför inte ännu är lämpad för rutinmässig klinisk diagnostik. I motsats härtill kan MV isoleras mycket snabbare och på grund av sin större storlek, kan lätt analyseras genom flödescytometri utan att man behöver koppla dem till latexpärlor som det är nödvändigt för Exos 18, 21. Således, här presenterar vi ett protokoll som kan användas för den standardiserade isolering av MV från blodprov och den efterföljande karakteriseringen av MV subpopulationer genom flödescytometri. Detta protokoll gör det möjligt för vidare studier och djupgående karaktärisering av MV profiler i stora patientgrupper som kommer att krävas för att kunna använda MV för vardagliga klinisk diagnostik.
Nyligen genomförda studier på elbilar i blodet har visat att EV sammansättning och räknar ändras under orsaken till flera sjukdomar. Därför analys och ytterligare karakterisering av dessa elbilar är av stort intresse för att ytterligare utvärdera deras potentiella användning som sjukdoms biomarkörer för diagnos och prognos eller att utvärdera behandlingssvar. Protokollet som vi presenterar här möjliggör isolering av vesiklar med en diameter på upp till 600 nm, vilket inte innehåller några cellorganeller. Dessa observationer är i linje med den nuvarande definitionen av MV och utesluta förekomsten av apoptotiska kroppar 2. Med hjälp av Western blotting, kunde vi visa att de isolerade MV visar en hög expression av tubulin, medan tetraspanins CD9 och CD81 som ofta används som Exo markörer endast något uttrycks. Detta bekräftar att MV skiljer sig från Exos och passar till de senaste djupgående karakterisering och jämförelse av båda EV populationerna av proteomik 25.
innehåll "> Under förvärv av blodprov, är det viktigt att hålla tiden mellan venpunktion och förberedelse plasma så kort som möjligt för att förhindra MV nedbrytning. Dessutom skulle långvarig lagring av blodprover leda till aktivering av blodkroppar som orsakar förbättrad MV shedding och slutligen apoptos, vilket resulterar i frisättning av apoptotiska kroppar. ett annat viktigt övervägande för MV isolering är att förhindra kontaminering av MV preparat med plasmaproteiner eller mindre Exos. Därför är det viktigt att avlägsna så mycket av supernatanten som möjligt efter spinning ner MVS vid 14.000 x g. Sedan pelleten normalt är synlig och tätt fäst på väggen av röret, supematanten kan lätt avlägsnas med en pipettspets. i motsats till Exos vilka tenderar att bilda aggregat under framställningen genom höghastighetsultracentrifugering och är ofta svåra att resuspendera, inte detta problem uppstå med MV.Vår studie visar att det är möjble att karakterisera MV subpopulationer som är närvarande i blod genom flödescytometri. Även om detektionsgränsen för de flesta flödescytometrar är ca 200-300 nm, var MV reproducerbart mätt i givare samt cellodlingsprover med samma parametrar för analys och grindar som klart tillåts deras skillnad från bakgrundssignaler. Det är viktigt att kontrollera före mätningarna att den PBS som användes för analyserna inte innehåller några förorenande partiklar som kan orsaka en hög bakgrund under flödescytometri (Figur 3). Även om vissa mindre MV inte kan fångas i en flödescytometrisk metod upptäckte vi MV från alla stora blodcellpopulationer (t.ex. blodplättar, röda blodkroppar, leukocyter, endotelceller). I våra analyser har vi använt standard markörer för de olika blodkroppar som tidigare har hittats på MV 26 – 29. Det bör noteras att för att uppnå bästa möjliga resultat genom flödescytometri, than mängden och koncentrationen av alla antikroppar skall titreras på en MV prov som uttrycker antigenet av intresse. Om specifika MV subpopulationer i blod skall identifieras med högre specificitet, är det möjligt att utföra dubbel färgning mot två olika antigener närvarande på respektive MV och bara överväga alla dubbla positiva MV för efterföljande analyser 23. För närvarande finns det insatser för att definiera ett standardsortiment av MV subpopulationer i blodet hos friska individer 23,30. Dessa studier har redan visat att blodplätthärledda MV utgör den största befolkningen av MV i blod som är i överensstämmelse med våra observationer.
En fördel med flödescytometri att karakterisera MV prover är att denna metod är redan väl etablerad för diagnostiska ändamål i de flesta kliniska centra som skulle tillåta en eventuell användning av MV som biomarkörer i vardags klinisk diagnostik. Tidigare studier på elbilar i blod som har mest fokused på mindre Exos förlita sig på antingen specifika sorterings förfaranden för att selektivt analysera önskade Exo målgruppen 31,32 eller kräva ett tidskrävande (2 dagar) isolering process med koppling av Exos till latexkulor före analys 18. Våra egna opublicerade observationer tyder på att flödescytometrisk analys av MV från hela blodberedningar tillåter även detektion av MV såsom tumörhärrörande MV utan sådana urvalsprocesser.
Sammantaget protokollet presenteras här möjliggör snabb isolering av MV från perifera blodprover med standardlaboratorieutrustning och deras efterföljande karaktärisering med hjälp av flödescytometri och Western blotting. Hela processen kan utföras i ca 2 timmar som kommer att underlätta framtida studier på MV profiler i patienternas blod som krävs för att bedöma potentialen för MV som sjukdoms biomarkörer.
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center Göttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Göttingen) for his help with the electron microscopy of MVs.
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).
butterfly needle (21 gauge) | Hospira Deutschland GmbH | 490P29201 | |
Bovine serum albumin Fraction V | Roth | 8076.3 | For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6 |
For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20 | |||
CD235a-PE | Beckman Coulter | A07792 | use 5µl for staining |
CD45-FITC | Beckman Coulter | 7782 | use 5µl for staining |
CD62E-PE | Biolegend | 336008 | use 0.8µg for staining |
CD62P-PE | Biolegend | 304905 | use 0.1µg for staining |
CD81 antibody | Biolegend | 349501 | 1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
CD9 antibody | Immunotools | 21270091 | 1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting |
Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000 | Fujitsu Life Sciences | ||
DC protein assay kit II | Bio-Rad | 5000112 | |
ECL detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
EDTA vacutainers for blood collection | Sarstedt | 01.1605.001 | |
FACSCanto II | BD Biosciences | ||
fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 10091148 | heat-inactivated (30 min, 56°C) |
filter 0.22µm | Sarstedt | 83.1826.001 | |
HRP-coupled anti-mouse secondary antibody | santa cruz | sc-2005 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody | santa cruz | sc-2004 | use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T |
4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1 | Roth | K929.1 | |
microfuge SIGMA 1-15K | Sigma Laborzentrifugen | ||
milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk) | BioRad | 170-6404 | |
multifuge 3 L-R | Heraeus | ||
NanoSight LM10 | NanoSight Ltd. | ||
PBS, w/o Ca and Mg | Pan biotech | P04-36500 | |
perfusor syringe 50 mL | Braun | 8728844F | |
Ponceau-S staining solution | PanReac AppliChem | A2935,0500 | |
rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL) | Beckman Coulter | ||
rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL) | Beckman Coulter | ||
tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom) | BD Biosciences | 352054 | |
tubes for ultracentrifugation (15 mL) | Beckman Coulter | 344061 | |
tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm) | Beckman Coulter | 343778 | |
Tubulin antibody | Millipore | 05-829 | 1:5000 in 5%BSA in TBST |
ultracentrifuge Optima L-80 XP | Beckman Coulter | ||
ultracentrifuge TL-100 | Beckman Coulter | ||
valve filter Seraplas V15 | Sarstedt | 53,428 |