Cryosectioning de contigües Les régions d'un muscle squelettique de souris unique pour l'expression génique et analyses histologiques

Résumé

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

Résumé

Avec cette méthode, cryosections consécutifs sont recueillies pour permettre aux deux applications de microscopie pour l'histologie des tissus et à l'enrichissement de l'ARN pour l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. En règle générale, il est difficile d'obtenir une homogénéisation suffisante des petits échantillons de muscles squelettiques, car les volumes de tampon peut être trop faible pour des applications de broyage efficaces, mais sans rupture mécanique suffisante, l'architecture du tissu dense de limites musculaires pénétration des réactifs de tampon, ce qui provoque finalement le rendement en ARN faible. En suivant le protocole présenté ici, à 30 um coupes sont recueillies et mises en commun permettant cryosectioning et après l'homogénéisation de l'aiguille pour perturber mécaniquement le muscle, ce qui augmente la zone de surface exposée à la pénétration du tampon. Les principales limites de la technique est qu'elle nécessite un cryostat, et il est relativement faible débit. Cependant, l'ARN de haute qualité peut être obtenue à partir de petits échantillons de m groupécryosections uscle, ce qui rend cette méthode accessible pour de nombreux muscles squelettiques différents et d'autres tissus. Des analyses plus, cette technique permet appariées (par exemple, l' histopathologie des tissus et l' expression des gènes) des régions adjacentes d'un seul muscle squelettique de sorte que les mesures peuvent être comparées directement à travers les applications pour réduire l' incertitude expérimentale et de réduire les expérimentations animales réplicatives nécessaires pour approvisionner un petit tissu pour des applications multiples.

Introduction

Le but de cette technique est de faire de multiples analyses expérimentales par des modalités différentes, telles que l'histologie et l'expression des gènes, accessibles à partir d'un seul petit tissu source du muscle squelettique. applications de microscopie sont les plus sensibles à l'échantillon des méthodes de conservation, qui doit être soigneusement contrôlée afin de limiter la formation d'artefacts de cristaux de glace lors de la cryoconservation. Ainsi, le développement de la méthode est basé sur le muscle tibial antérieur (TA) musculaire et congelées partiellement recouvert d'enrobage de résine dans un liquide de bain de 2-méthylbutan....

Protocole

Toutes les procédures animales ont été approuvées par l'Université de Géorgie Institutional Animal Care et utilisation Comité en vertu de l'utilisation des animaux protocole A2013 07-016 (Beedle).

1. Cryoconservation du muscle squelettique non fixé

1. Préparation
   1. Couper le liège en petits carrés (environ 1 cm x 1 cm) avec une lame de rasoir, écrire sur le bouchon avec un marqueur à pointe fine qui est résistant à la 2-méthylbutane pour identifier la souris source et le muscle, et faire une coupe très faible (environ 1 mm) sur toute la surface supérieure. Insérez une lamelle en plastique dans la coupe à utiliser pour orienter le tissu.....

Résultats

ARN Muscle cryosection est de haute qualité et offre un rendement suffisant pour la plupart des applications

Les analyses des seize squelettiques préparations d'ARN musculaires sont présentés dans le tableau 1 , en utilisant 19,4 mg de 41 à Pooled jambier antérieur (TA) , le muscle des souris témoins 8. Les deux à gauche (L) et droite muscles (R) TA ont été préparés dans des expériences de régénération avec d.......

Discussion

Pour obtenir les meilleurs résultats avec cette méthode, gardez l'intégration résine limitée au tiers inférieur ou la moitié du muscle pendant la cryoconservation de tissu, car l'excès de résine va ralentir la collecte des cryosections regroupées et peut augmenter l'incorporation de contamination de la résine dans l'isolement de l'ARN. En outre, une attention particulière lors de l'aiguille d'homogénéisation est important de maximiser le rendement et minimiser la probabilité d'obstruction.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Liège	VWR Scientific	23420-708	Coupez en petits carrés avec une lame tranchante.
Lamelle en plastique	Fisher Scientific	12-547	Utilisée pour orienter le muscle pendant la congélation.
Thermomètre basse température	VWR Scientific	89370-158
2-méthylbutane	Sigma	M32631-4L	Attention : produit chimique dangereux. Stocker dans une armoire inflammable.
Résine d’enrobage : « cryomatrix"Thermo	Fisher Scientific	6769006	D’autres résines d’enrobage peuvent être substituées à la cryomatrice.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 avec porte-lames jetable	Tout cryostat en état de marche doit suffire pour le protocole.
Lame de cryostat jetable	Thermo Fisher Scientific	3052835	Utilisez une lame ou un couteau approprié pour le cryostat à utiliser.
Solution de décontamination à l’ARNase : « RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Balance analytique	Mettler Toledo	XS64
Pinceau	Daler Rowney	214900920	Utiliser pour manipuler les cryosections. Peut être trouvé dans les magasins avec des fournitures d’art simples.
Lame de rasoir	VWR Scientific	55411-050
Lame de microscope	VWR Scientific	48311600
Réactif d’extraction organique d’ARN : TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Attention : Le TRIzol est un produit chimique dangereux. Remarque : Seuls les réactifs d’extraction organiques sont recommandés pour l’extraction de l’ARN du muscle squelettique.
Aiguille de calibre 18	VWR Scientific	BD305185
Aiguille de calibre 22	VWR Scientific	BD305155
Aiguille de calibre 26	VWR Scientific	BD305115	en option. Peut être utilisé pour une troisième série de trituration d’échantillons dans le protocole d’extraction d’ARN.
Seringue de 1 ml	VWR Scientific	BD309659	Pour les échantillons de très grande valeur, une seringue Luer-Lok est recommandée (par exemple , VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
Pour 70 % d’éthanol dans l’eau DEPC : alcool à 200 degrés	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mélanger 35 ml d’alcool 200 proof + 15 ml d’eau DEPC.
Pour 70 % d’éthanol dans l’eau DEPC : Eau traitée DEPC	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml d’alcool 200 proof + 15 ml d’eau DEPC.
Kit de purification de l’ARN : Minikit d’ARN PureLink	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Étapes finales de la préparation de l’ARN.
Eau sans DNase/Rnase  ;	L’eau traitée Gibco	10977	DEPC peut également être utilisée.
Spectrophotomètre : Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Traitez l’ARN purifié pour éliminer toute contamination de l’ADN avant les applications en aval.
Stylo hydrophobe	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco’s PBS	Gibco	14190	PBS pour le protocole d’immunofluorescence.
Sérum d’âne	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Réhydratez le stock de sérum d’âne normal selon les instructions du fabricant, puis diluez une aliquote à 5 % pour l’immunofluorescence. Un sérum de chèvre normal peut également être utilisé.
Anticorps eMHC	Université de l’Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Âne anti-lapin AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Chèvre anti-souris IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6- diamidino-2-phénylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Média de montage aqueux : Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	N’utilise que des supports de montage conçus pour les applications fluorescentes avec des propriétés anti-décoloration.
Lamelle en verre	VWR Scientific	16004-314	Utilisation pour le montage de lames à l’extrémité du protocole d’immunofluorescence
Logiciel d’analyse d’images : ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, ou des produits plus avancés	Freeware ImageJ devraient également fonctionner pour le comptage manuel. Des logiciels plus avancés avec des capacités de segmentation peuvent permettre une automatisation partielle du processus ; par exemple , ImageProPremier.
Fusionner et cartographier les images de section : Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 n’est plus fabriqué. D’autres options pour la cardiotoxine sont EMD Millipore #217503 ; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618 ; ou Ge Script # RP17303 ; Mais ceux-ci n’ont pas été validés.
kit de transcription inverse : Superscript III Système de synthèse premier brin	Thermo Fisher Scientific	18080051	Tous les réactifs de transcription inverse validés et de haute qualité peuvent être utilisés.
PCR standard : Système de polymérase GoTaq Flexi	Promega	M8298	Tout système de polymérase Taq validé et de haute qualité peut être utilisé. Si le séquençage de l’ADN doit être utilisé pour une application en aval de la PCR, un système de PCR haute fidélité doit être utilisé à la place.
SYBR vert	Thermo Fisher Scientific	S7585	À utiliser en qPCR lorsque vous n’utilisez pas un mélange maître qPCR dédié. À utiliser avec SuperROX (pour les instruments Applied Biosystems) et GoTaq Flexi polymérase et tampons.
ROX : SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX est plus stable dans la réaction PCR, il est donc préférable pour une utilisation comme colorant de référence passif qPCR par rapport au ROX (carboxy-X-rhodamine). Pour la qPCR avec les instruments Applied Biosystems
PCR en temps réel	Applied Biosystems	7900HT

anticorps