Cryosectioning de contigües Les régions d'un muscle squelettique de souris unique pour l'expression génique et analyses histologiques

Summary

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 – 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

Abstract

Avec cette méthode, cryosections consécutifs sont recueillies pour permettre aux deux applications de microscopie pour l'histologie des tissus et à l'enrichissement de l'ARN pour l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. En règle générale, il est difficile d'obtenir une homogénéisation suffisante des petits échantillons de muscles squelettiques, car les volumes de tampon peut être trop faible pour des applications de broyage efficaces, mais sans rupture mécanique suffisante, l'architecture du tissu dense de limites musculaires pénétration des réactifs de tampon, ce qui provoque finalement le rendement en ARN faible. En suivant le protocole présenté ici, à 30 um coupes sont recueillies et mises en commun permettant cryosectioning et après l'homogénéisation de l'aiguille pour perturber mécaniquement le muscle, ce qui augmente la zone de surface exposée à la pénétration du tampon. Les principales limites de la technique est qu'elle nécessite un cryostat, et il est relativement faible débit. Cependant, l'ARN de haute qualité peut être obtenue à partir de petits échantillons de m groupécryosections uscle, ce qui rend cette méthode accessible pour de nombreux muscles squelettiques différents et d'autres tissus. Des analyses plus, cette technique permet appariées (par exemple, l' histopathologie des tissus et l' expression des gènes) des régions adjacentes d'un seul muscle squelettique de sorte que les mesures peuvent être comparées directement à travers les applications pour réduire l' incertitude expérimentale et de réduire les expérimentations animales réplicatives nécessaires pour approvisionner un petit tissu pour des applications multiples.

Introduction

Le but de cette technique est de faire de multiples analyses expérimentales par des modalités différentes, telles que l'histologie et l'expression des gènes, accessibles à partir d'un seul petit tissu source du muscle squelettique. applications de microscopie sont les plus sensibles à l'échantillon des méthodes de conservation, qui doit être soigneusement contrôlée afin de limiter la formation d'artefacts de cristaux de glace lors de la cryoconservation. Ainsi, le développement de la méthode est basé sur le muscle tibial antérieur (TA) musculaire et congelées partiellement recouvert d'enrobage de résine dans un liquide de bain de 2-méthylbutane d'azote refroidi à -140 ° C en tant que matériau de base pour la microscopie par immunofluorescence et l'expression génique analyses.

La nécessité d'utiliser le même matériau source pour diverses approches techniques est particulièrement important pour les expériences à base d'injection intramusculaire où les muscles droit et gauche représentent les différentes conditions expérimentales, l'une et l'autre contrôle. Par exemple, dans les études de régénération musculaire, une muSCLE est injecté avec une toxine pour causer des dommages aux tissus répandus tandis que le muscle controlatéral sert de contrôle du véhicule à injection ^1. De même, les études de thérapie génique pour les troubles musculaires commencent généralement à la validation du vecteur de thérapie génique par injection intramusculaire , à comparer avec le vecteur vide, vecteur ou sans rapport avec le contrôle du véhicule du côté controlatéral ^2. Par conséquent, il est impossible de l'obtenir dans chaque muscle TA pour une application différente.

Les stratégies communes pour faire face à ce problème sont les suivants: i) d'utiliser un groupe musculaire différent pour chaque application, ii) d'utiliser des souris supplémentaires, ou iii) pour couper un morceau de muscle pour chaque application. Cependant, des différences substantielles entre les groupes musculaires, il est difficile de comparer les données à partir d'applications séparées, et les animaux supplémentaires augmentent la charge et sont peu justifiées si d'autres alternatives existent. En divisant le muscle après dissection à la source des applications différentes est la meilleure option in de nombreux cas. Toutefois, les morceaux de muscles sont souvent trop petits pour utiliser la pulvérisation sous azote liquide ou par des techniques de broyage mécanique pour l' homogénéisation ^2-5. Le muscle est un tissu très structurel garnie de protéines de la matrice extracellulaire et contractiles, l'homogénéisation mécanique inadéquate conduit à un faible rendement de l'ADN ultérieur, l'ARN ou une protéine. La méthode détaillée ici permet de petites quantités de tissu d'un muscle de la source pour une utilisation dans des applications multiples, et l'inclusion de cryosectioning et l'aiguille trituration améliore l'homogénéisation mécanique pour un meilleur rendement de l'ARN.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par l'Université de Géorgie Institutional Animal Care et utilisation Comité en vertu de l'utilisation des animaux protocole A2013 07-016 (Beedle). 1. Cryoconservation du muscle squelettique non fixé Préparation Couper le liège en petits carrés (environ 1 cm x 1 cm) avec une lame de rasoir, écrire sur le bouchon avec un marqueur à pointe fine qui est résistant à la 2-méthylbutane pour identifier la souris source et le mu…

Representative Results

ARN Muscle cryosection est de haute qualité et offre un rendement suffisant pour la plupart des applications Les analyses des seize squelettiques préparations d'ARN musculaires sont présentés dans le tableau 1 , en utilisant 19,4 mg de 41 à Pooled jambier antérieur (TA) , le muscle des souris témoins 8. Les deux à gauche (L) et droite muscles (R) TA ont été préparés dans des expériences de régé…

Discussion

Pour obtenir les meilleurs résultats avec cette méthode, gardez l'intégration résine limitée au tiers inférieur ou la moitié du muscle pendant la cryoconservation de tissu, car l'excès de résine va ralentir la collecte des cryosections regroupées et peut augmenter l'incorporation de contamination de la résine dans l'isolement de l'ARN. En outre, une attention particulière lors de l'aiguille d'homogénéisation est important de maximiser le rendement et minimiser la probabilité d&…

Materials

Cork	VWR Scientific	23420-708	Cut into small squares with a sharp blade.
Plastic coverslip	Fisher Scientific	12-547	Used to orient the muscle during freezing.
Low temperature thermometer	VWR Scientific	89370-158
2-methylbutane	Sigma	M32631-4L	Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet.
Embedding resin: "cryomatrix"	Thermo Fisher Scientific	6769006	Other embedding resins can be substituted for cryomatrix.
Cryostat	Thermo Fisher Scientific	microm HM550 with disposable blade carrier	Any working cryostat should be sufficient for the protocol.
Disposable cryostat blade	Thermo Fisher Scientific	3052835	Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used.
RNAse decontamination solution: "RNase Zap"	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Analytical balance	Mettler Toledo	XS64
Paint brush	Daler Rowney	214900920	Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies.
Razor blade	VWR Scientific	55411-050
Microscope slide	VWR Scientific	48311600
RNA organic extraction reagent: TRIzol	Thermo Fisher Scientific	15596026	Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle.
18 gauge needle	VWR Scientific	BD305185
22 gauge needle	VWR Scientific	BD305155
26 gauge needle	VWR Scientific	BD305115	Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol.
1 mL syringe	VWR Scientific	BD309659	For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628).
1-bromo-3-chloropentane (BCP)	Sigma	B9673
For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol	Decon Laboratories, Inc.	+M18027161M	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water.
For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water	Thermo Fisher Scientific	AM9922	Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water.
RNA purification kit: PureLink RNA minikit	Thermo Fisher Scientific	12183018A	Final steps of RNA preparation.
DNase/Rnase-free water	Gibco	10977	DEPC-treated water can also be used.
Spectrophotometer: Nanodrop 2000	Thermo Fisher Scientific	NanoDrop 2000
Dnase I	Thermo Fisher Scientific	AM2222	Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications.
Hydrophobic pen	Thermo Fisher Scientific	8899
Dulbecco's PBS	Gibco	14190	PBS for immunofluorescence protocol.
Donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc	017-000-121	Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence.  Normal goat serum can also be used.
eMHC antibody	University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank	F1.652
Collagen VI antibody	Fitzgerald Industries	#70R-CR009x
Donkey anti-rabbit AlexaFluor488	Thermo Fisher Scientific	A21206
Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546	Thermo Fisher Scientific	A21123
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)	Thermo Fisher Scientific	D1306
Aqueous mounting media: Permafluor	Thermo Fisher Scientific	TA-030-FM	Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties.
Glass coverslip	VWR Scientific	16004-314	Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl
Image analysis software: ImageProExpress	Media Cybernetics, Inc.	Image-Pro Express, or more advanced products	Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process.  E.g. ImageProPremier.
Merge and map section images: Photoshop	Adobe	Photoshop
Cardiotoxin	Sigma	C9659	Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated.
reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system	Thermo Fisher Scientific	18080051	Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used.
Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system	Promega	M8298	Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead.
SYBR green	Thermo Fisher Scientific	S7585	For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers.
ROX: SuperROX, 15 mM	BioResearch Technologies, Inc. Novato CA	SR-1000-10	SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments
Real-time PCR	Applied Biosystems	7900HT