Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית
Summary
קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 – 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.
Abstract
באמצעות שיטה זו, ברציפות cryosections נאספים כדי לאפשר הן יישומים במיקרוסקופ לצורך היסטולוגיה רקמה והעשרה של רנ"א עבור ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי השלד יחיד העכבר. בדרך כלל, אתה עשוי להתקשות להשיג הומוגניזציה נאותה דגימות שריר שלד קטנות בגלל כרכי חיץ עשויים להיות נמוכים מדי עבור יישומי שחיקה יעילים, עדיין ללא הפרעה מכאנית מספיק, ארכיטקטורת הרקמה הצפופה של חדירה לתחום שריר של ריאגנטים חיץ, גורמת בסופו של דבר תשואת RNA נמוכה. על ידי ביצוע הפרוטוקול שדווח כאן, 30 מיקרומטר חלקים נאספים ונקווים המאפשרים cryosectioning ויצירת הומוגניות מחט לאחר מכנית לשבש את השריר, הגדלת שטח הפנים החשוף לחדירת חיץ. המגבלות העיקריות של הטכניקה הן כי זה דורש cryostat, וזה יחסית תפוקה נמוכה. עם זאת, RNA באיכות גבוהה ניתן להשיג דגימות קטנות של מטר ויקווהcryosections uscle, מה שהופך שיטה זו נגישה עבור שרירי שלד ורקמות אחרות רבים ושונים. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת ניתוחים מתאימים (למשל, histopathology רקמות ביטוי גנים) מאזורים סמוכים של שרירי שלד יחידים כך שמדידות ניתן להשוות באופן ישיר בין יישומים כדי לצמצם את אי הוודאות ניסיונית להפחית ניסויים בבעלי חיים בשכפול הדנ"א צורך למקור רקמה קטנה עבור יישומים מרובים.
Introduction
מטרת טכניקה זו היא להפוך ניתוחים ניסיוניים מרובים על ידי שיטות שונות, כגון ביטוי היסטולוגיה גן, נגישות מכל רקמה ממקור שרירי שלד אחת קטנה. יישומים מיקרוסקופים הם הרגישים ביותר כדי לטעום דרכי שימור, אשר חייב להיות מבוקר בקפידה כדי להגביל את ההיווצרות של חפצי גביש הקרח במהלך cryopreservation. לפיכך, פיתוח שיטה מבוסס על קדמי tibialis (ת"א) שריר קפוא מכוסה חלקית עם ההטבעה שרפה באמבט חנקן מקורר נוזל -140 ° C 2-methylbutane כחומר המקור הוא מיקרוסקופיה immunofluorescence ביטוי גני המנתח.
הצורך להשתמש באותו מקור חומר עבור גישות טכניות מגוונות חשוב במיוחד עבור ניסויים מבוססי זריקה תוך שרירית שבו השרירים ימין ועל שמאל מייצגים תנאים שונים, אחד ניסוי ובקרה אחד. לדוגמה, במחקרים התחדשות שריר, mu אחדscle מוזרק עם רעלן לגרום נזק לרקמות נרחבת תוך השריר הנגדי משמש כביקורת הרכב מוזרק 1. בדומה לכך, מחקרי ריפוי גנטי להפרעות שריר בדרך כלל מתחילים עם אימות של וקטור הריפוי הגנטי על ידי זריקה תוך שרירית להיות לעומת וקטור ריק, וקטור קשור או שליטה ברכב בצד הנגדי 2. לכן, אין זה אפשרי למקור כל שריר ת"א ליישום אחר.
אסטרטגיות נפוצות להתמודד עם בעיה זו הן: i) להשתמש קבוצת שרירים שונה עבור כל יישום, ii) להשתמש עכברים נוספים, או iii) כדי לחתוך חתיכה של השריר עבור כל יישום. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין קבוצות השרירות להקשות להשוות נתונים מיישומים נפרדים, וחיות נוספות להגדיל הוצאה והם גרועים מוצדקים אם קיימות חלופות אחרות. חלוקת השרירים לאחר דיסקציה למקור יישומים שונים היא i האפשרות הטוב ביותרבמקרים רבים n. עם זאת, את החלקים שרירים הם בדרך כלל קטנים מדי לשימוש אִבּוּק תחת חנקן נוזלי או טכניקות שחיקה מכנית עבור המגון 2-5. כמו שריר היא רקמה מבנית מאוד עמוסה חלבוני מטריקס התכווצות תאיים, המגון מכאני לקוי מוביל בתשואה נמוכה של DNA, RNA או חלבון שלאחר מכן. השיטה המפורטת כאן מאפשרת כמויות קטנות של רקמת שריר מקור אחד לשימוש ביישומים מרובים, וההכללה של טחינה דקה cryosectioning ומחט משפר המגון מכנה תשואת RNA טובה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עם שיטה זו, לשמור הטבעת השרף המוגבל לנמוך השליש או המחצית של השריר במהלך cryopreservation רקמות בגלל שרף עודף יאט את האוסף של cryosections ונקווה ועלול להגדיל הטבעת זיהום שרף בידוד RNA. כמו כן, תשומת לב קפדנית במהלך המגון מחט חשוב למקסם את התשואה ולה?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
- Foltz, S. J., et al. Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice. PLoS One. 11 (1), 0147049 (2016).
- Bartoli, M., et al. Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies. Gene Ther. 13, 20-28 (2006).
- Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies. Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).
- Beedle, A. M., et al. Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy. J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).
- Foltz, S. J., et al. Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy. Skeletal Muscle. 6, 20 (2016).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).
- Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells. BMC Res. Notes. 3, 211 (2010).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J. Vis. Exp. (45), e2565 (2010).
- Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4. Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).
- Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4. Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).
- Chomczynski, P., Mackey, K. Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation. Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).
- Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation. J. Biol. Methods. 2 (2), 20 (2015).
- Guo, D., Catchpoole, D. R. Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue. BioTechniques. 34, 48-50 (2003).
- Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining. J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).
- Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis. Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).
- Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle. Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).
- Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. Laser capture microdissection technology. Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).
