Cryosectioning de regiones contiguas de un músculo esquelético solo ratón para la expresión de genes y análisis histológicos
Summary
Consecutivos crio-secciones se recogen para permitir que las aplicaciones histológicas y enriquecimiento de ARN para mediciones de la expresión de genes usando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. ARN de alta calidad se obtiene a partir de 20 – 30 mg de cryosections y mediciones agrupadas están directamente comparación entre aplicaciones.
Abstract
Con este método, cryosections consecutivas se recogen para permitir que las aplicaciones de microscopía para histología de tejido y el enriquecimiento de ARN para la expresión de genes utilizando las regiones adyacentes de un músculo esquelético solo ratón. Por lo general, es difícil lograr una homogeneización adecuada de pequeñas muestras de músculo esquelético debido a los volúmenes de tampón puede ser demasiado baja para aplicaciones de molienda eficiente, pero sin la suficiente alteración mecánica, la arquitectura del tejido denso de los límites del músculo penetración de los reactivos de amortiguamiento, en última instancia, causando bajo rendimiento de ARN. Siguiendo el protocolo informado aquí, 30 micras secciones se recogen y se agruparon permitiendo cryosectioning y posterior homogeneización aguja para interrumpir mecánicamente el músculo, aumentar el área de superficie expuesta para la penetración buffer. Las limitaciones principales de la técnica son que requiere un criostato, y es relativamente bajo rendimiento. Sin embargo, el ARN de alta calidad puede obtenerse a partir de pequeñas muestras de m agrupadocryosections uscle, haciendo de este método accesible para muchas diferentes músculos esqueléticos y otros tejidos. Análisis Además, esta técnica permite adaptado (por ejemplo, la histopatología de tejidos y la expresión de genes) de las regiones adyacentes de un solo músculo esquelético de modo que las mediciones se pueden comparar directamente entre aplicaciones para reducir la incertidumbre experimental y para reducir los experimentos con animales replicativos necesario a la fuente de un pequeño tejido para múltiples aplicaciones.
Introduction
El objetivo de esta técnica es hacer múltiples análisis experimentales por diferentes modalidades, como la histología y la expresión génica, accesible desde un solo pequeño tejido fuente músculo esquelético. aplicaciones de microscopía son los más sensibles a la muestra métodos de conservación, que deben ser controladas cuidadosamente para limitar la formación de artefactos de cristales de hielo durante la criopreservación. Por lo tanto, el desarrollo del método se basa en el tibial anterior (TA) de músculo congelado parcialmente cubierta con incrustación de resina en un baño de 2-metilbutano enfriado con nitrógeno líquido -140 ° C como el material de origen tanto para microscopía de inmunofluorescencia y análisis de la expresión génica.
La necesidad de utilizar la misma fuente de material para diversos enfoques técnicos es particularmente importante para los experimentos basados en la inyección intramuscular donde los músculos izquierda y derecha representan diferentes condiciones, uno experimental y uno de control. Por ejemplo, en estudios de regeneración del músculo, uno muSCLE se inyecta con una toxina para causar daño tisular generalizado mientras que el músculo contralateral sirve como control 1 del vehículo de inyección. Del mismo modo, los estudios de terapia génica para trastornos musculares comienzan típicamente con la validación del vector de terapia génica mediante inyección intramuscular a ser comparado con el vector vacío, vector no relacionado o de control del vehículo en el lado contralateral 2. Por lo tanto, no es posible a la fuente de cada músculo TA para una aplicación diferente.
Las estrategias comunes para hacer frente a este problema son: i) utilizar un grupo muscular diferente para cada aplicación, ii) utilizar los ratones adicionales, o iii) para cortar un trozo de músculo para cada aplicación. Sin embargo, las diferencias sustanciales entre los grupos musculares hacen que sea difícil comparar los datos de aplicaciones por separado, y los animales adicionales aumentan los gastos y son poco justificada si existen otras alternativas. Dividiendo el músculo después de la disección a la fuente de las diferentes aplicaciones es la mejor opción in muchos casos. Sin embargo, las piezas musculares son a menudo demasiado pequeñas para ser usadas pulverización en atmósfera de nitrógeno líquido o técnicas de molienda mecánica para la homogeneización 2-5. Como el músculo es un tejido altamente estructural lleno de proteínas de la matriz extracelular y contráctiles, inadecuado homogeneización mecánica conduce a un bajo rendimiento de ADN posterior, ARN o proteína. El método detallado aquí permite a las pequeñas cantidades de tejido de un músculo fuente para el uso en varias aplicaciones, y la inclusión de cryosectioning y la aguja trituración mejora la homogeneización mecánica para un mejor rendimiento de ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
To achieve best results with this method, keep embedding resin restricted to the lower third or half of the muscle during tissue cryopreservation because excess resin will slow the collection of the pooled cryosections and may increase embedding resin contamination in the RNA isolation. Also, careful attention during needle homogenization is important to maximize yield and minimize the probability of clogging the needle. The protocol may be modified by using a Luer-Lok syringe to protect against sample loss if the needle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Madison Grant, Steven Foltz, Halie Zastre and Junna Luan provided technical assistance. Research reported in this publication was supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under award number AR065077. The content is solely the responsibility of the author and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Cork | VWR Scientific | 23420-708 | Cut into small squares with a sharp blade. |
| Plastic coverslip | Fisher Scientific | 12-547 | Used to orient the muscle during freezing. |
| Low temperature thermometer | VWR Scientific | 89370-158 | |
| 2-methylbutane | Sigma | M32631-4L | Caution: hazardous chemical. Store in flammable cabinet. |
| Embedding resin: "cryomatrix" | Thermo Fisher Scientific | 6769006 | Other embedding resins can be substituted for cryomatrix. |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific | microm HM550 with disposable blade carrier | Any working cryostat should be sufficient for the protocol. |
| Disposable cryostat blade | Thermo Fisher Scientific | 3052835 | Use an appropriate blade or knife for the cryostat to be used. |
| RNAse decontamination solution: "RNase Zap" | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| Analytical balance | Mettler Toledo | XS64 | |
| Paint brush | Daler Rowney | 214900920 | Use to handle cryosections. Can be found with in stores with simple art supplies. |
| Razor blade | VWR Scientific | 55411-050 | |
| Microscope slide | VWR Scientific | 48311600 | |
| RNA organic extraction reagent: TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Caution: TRIzol is a hazardous chemical. Note: Only organic extraction reagents are recommended for RNA extraction from skeletal muscle. |
| 18 gauge needle | VWR Scientific | BD305185 | |
| 22 gauge needle | VWR Scientific | BD305155 | |
| 26 gauge needle | VWR Scientific | BD305115 | Optional. Can be used for a third round of sample trituration in the RNA extraction protocol. |
| 1 mL syringe | VWR Scientific | BD309659 | For very high value samples, a luer-lok syringe is recommended (e.g. VWR BD309628). |
| 1-bromo-3-chloropentane (BCP) | Sigma | B9673 | |
| For 70% ethanol in DEPC water: 200 proof alcohol | Decon Laboratories, Inc. | +M18027161M | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| For 70% ethanol in DEPC water: DEPC-treated water | Thermo Fisher Scientific | AM9922 | Mix 35 ml 200 proof alcohol + 15 mL DEPC water. |
| RNA purification kit: PureLink RNA minikit | Thermo Fisher Scientific | 12183018A | Final steps of RNA preparation. |
| DNase/Rnase-free water | Gibco | 10977 | DEPC-treated water can also be used. |
| Spectrophotometer: Nanodrop 2000 | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | AM2222 | Treat purified RNA to remove any DNA contamination before downstream appications. |
| Hydrophobic pen | Thermo Fisher Scientific | 8899 | |
| Dulbecco's PBS | Gibco | 14190 | PBS for immunofluorescence protocol. |
| Donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc | 017-000-121 | Rehydrate normal donkey serum stock according to the manufacturer's instructions, then dilute an aliquot to 5% for immunofluorescence. Normal goat serum can also be used. |
| eMHC antibody | University of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank | F1.652 | |
| Collagen VI antibody | Fitzgerald Industries | #70R-CR009x | |
| Donkey anti-rabbit AlexaFluor488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Goat anti-mouse IgG1 AlexaFluor546 | Thermo Fisher Scientific | A21123 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Aqueous mounting media: Permafluor | Thermo Fisher Scientific | TA-030-FM | Only use mounting media designed for fluorescent applications with anti-fade properties. |
| Glass coverslip | VWR Scientific | 16004-314 | Use for mounting slides at the end of immunofluorescence protocl |
| Image analysis software: ImageProExpress | Media Cybernetics, Inc. | Image-Pro Express, or more advanced products | Freeware ImageJ should also work for manual counting. More advanced software with segmentation abiities may allow partial automation of the process. E.g. ImageProPremier. |
| Merge and map section images: Photoshop | Adobe | Photoshop | |
| Cardiotoxin | Sigma | C9659 | Sigma C9659 has been discontinued. Other options for cardiotoxin are EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; or Ge Script # RP17303; but these have not been validated. |
| reverse transcription kit: Superscript III First-strand synthesis system | Thermo Fisher Scientific | 18080051 | Any validated, high quality reverse transcription reagents can be used. |
| Standard PCR: GoTaq Flexi polymerase system | Promega | M8298 | Any validated, high quality Taq polymerase system can be used. If DNA sequencing is to be used for any application downstream of the PCR, then a high fidelity PCR system should be used instead. |
| SYBR green | Thermo Fisher Scientific | S7585 | For use in qPCR when not using a dedicated qPCR master mix. Use with SuperROX (for Applied Biosystems instruments) and GoTaq Flexi polymerase and buffers. |
| ROX: SuperROX, 15 mM | BioResearch Technologies, Inc. Novato CA | SR-1000-10 | SuperROX is more stable in the PCR reaction, so it is preferred for use as a qPCR passive reference dye over ROX (carboxy-X-rhodamine). For qPCR with Applied Biosystems instruments |
| Real-time PCR | Applied Biosystems | 7900HT |
References
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