Лигандом Нано-кластер Массивы в поддерживаемому липидный бислой
Summary
Мы представляем протокол для функционализации стекла с нанометровыми белковыми пятнами, окруженными жидкостью липидного бислой. Эти субстраты совместимы с современной оптической микроскопии и, как ожидается, служить в качестве платформы для клеточной адгезии и миграции исследований.
Abstract
В настоящее время существует значительный интерес к созданию упорядоченных массивов адгезивных белков островков в море пассивирован- поверхности для биологических исследований клеток. В последние года она становится все более очевидной, что живые клетки реагируют не только на биохимическую природу молекул, представленных им, но и к тому, как представлены этим молекулам. Создание белковых микро-модели, таким образом, в настоящее время стандартом во многих биологических лабораториях; нано-структура также является более доступной. Однако, в контексте межклеточных взаимодействий, существует необходимость в шаблон не только белки, но и липидные двухслойные. Такой двойной Proteo-липидной структурирование до сих пор не было легко доступны. Мы предлагаем легкое техника для создания белковых нано-точек, нанесенных на стекле и предложить способ засыпки между точечным пространством с поддерживаемым липидным бислой (SLB). С фото-отбеливание трассера флуоресцентные липиды включены в БВУ, мы показали, что бислой обладает значительным в-плана текучесть. Функционализующих белковые точки флуоресцентных групп позволяют им изображение и показать, что они упорядочены в правильной гексагональной решетке. Типичный размер точек составляет около 800 нм, а расстояние между продемонстрирована здесь составляет 2 мкм. Эти подложки, как ожидается, чтобы служить в качестве полезных платформ для клеточной адгезии, миграции и исследований механо-зондирования.
Introduction
Адгезия клеток происходит через специализированные молекул клеточной адгезии (АМСГ), белки, присутствующие на клеточной мембране, которые способны связываться с их аналогом на внеклеточном матриксе или на другую клетку. На прилипших клетки, большинство молекул адгезии , включая повсеместные интегриный и кадгерин, находятся в виде кластеров 1. Взаимодействие Т-лимфоцитов (Т-клетки) с антиген-представляющими клетками (АРС) обеспечивает особенно яркой иллюстрацией важности кластеров рецепторов, сформированных на границе раздела между двумя клетками – часто называют иммунологический синапс. При формировании первого контакта с рецепторами клеток АРС, Т (TCR) на поверхности масштабных кластеров формы клеток микронного Т , которые служат в качестве сигнальных платформ 2, 3, 4, и, в конечном счете централизованных , чтобы сформировать больший центральный надмолекулярный кластер (cSMAC )деваха = "Xref"> 5, 6, 7. В последнее время было показано , что на стороне APC, лиганды рецептора Т – клеток, также сгруппированы 8.
В контексте Т – клеток-APC взаимодействия, развертывание гибридных систем, где АРС имитировало искусственную поверхность функционализированной с соответствующими белками, значительно продвинул наше понимание синаптического интерфейса 2, 3, 4, 5, 6, 7 , В этом контексте имеет большое значение для разработки APC мимические поверхностей, которые захватывают один или несколько аспектов клетки-мишени. Например, если лиганды привиты на поддерживаемых липидных бислоев, они могут диффундировать в плоскости бислоя, имитировать ситуацию на поверхности APC и в то же время позволяет формированиеcSMAC 6, 7. Аналогичным образом , кластеры на APC были имитировали путем создания островков лигандов в море полимеров 9, 10, 11, 12, 13, 14. Тем не менее, эти две функции до сих пор не были объединены.
Здесь мы описываем технику, чтобы создать новую нано-точек анти-CD3 (антитело, которое нацеливает комплекс TCR), окруженный липидный бислой с диффундирующими липидами. Бислой осаждают с помощью Ленгмюра-Блоджетт / Ленгмюра-Schaefer технику 7, 15, 16 и , если желательно, может быть функционализированный с определенным белком – например, лиганд клеточного интегрина Т ( так называемый ICAM – 1). Кроме того, анти-CD3 белка точек КоуLD быть заменен другим антителом или CAM. В то время как мы выбрали белки для дальнейшего использования в качестве платформы для исследований клеточной адгезии Т, стратегия подробно здесь может быть адаптирована для любого белка и даже ДНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках протокола, описанном выше, связаны с образованием белковых нано-точек или задним заполнением пространства вокруг точек с помощью поддерживаемого липидного бислой. Первый важный шаг в отношении белкового нано-точка является подготовкой борта-маска. Чистка кр…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Лоран Limozin, Пьер Диллард и Астрид Валь для продолжения плодотворной дискуссии по поводу приложений сотовой связи. Мы также благодарим Фредерика Беду от PLANETE чистых помещений объекта за его помощь с наблюдениями SEM. Эта работа была частично финансируется Европейским исследовательским советом по грант № 307104 FP / 2007-2013 / ERC.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2002).
- Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. T Cell Receptor-Proximal Signals Are Sustained in Peripheral Microclusters and Terminated in the Central Supramolecular Activation Cluster. Immunity. 25 (1), 117-127 (2006).
- Kaizuka, Y., et al. Mechanisms for segregating T cell receptor and adhesion molecules during immunological synapse formation in Jurkat T cells. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (51), 20296-20301 (2007).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
- Huppa, J. B., Davis, M. M. T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nat Rev Immunol. 3 (12), 973-983 (2003).
- Grakoui, A., et al. The Immunological Synapse: A Molecular Machine Controlling T Cell Activation. Science. 285, 221-228 (1999).
- Dillard, P., Varma, R., Sengupta, K., Limozin, L. Ligand-mediated friction determines morphodynamics of spreading T cells. Biophys J. 107 (11), 2629-2638 (2014).
- Lu, X., et al. Endogenous viral antigen processing generates peptide-specific MHC class I cell-surface clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15407-15412 (2012).
- Pi, F., Dillard, P., et al. Size-Tunable Organic Nanodot Arrays: A Versatile Platform for Manipulating and Imaging Cells. Nano Lett. 15 (8), 5178-5184 (2015).
- Deeg, J., et al. T cell activation is determined by the number of presented antigens. Nano Lett. 13 (11), 5619-5626 (2013).
- Delcassian, D., et al. Nanoscale ligand spacing influences receptor triggering in T cells and NK cells. Nano Lett. 13 (11), 5608-5614 (2013).
- Matic, J., Deeg, J., Scheffold, A., Goldstein, I., Spatz, J. P. Fine tuning and efficient T cell activation with stimulatory aCD3 nanoarrays. Nano Lett. 13 (11), 5090-5097 (2013).
- Dillard, P., Pi, F., Lellouch, A. C., Limozin, L., Sengupta, K. Nano-clustering of ligands on surrogate antigen presenting cells modulates T cell membrane adhesion and organization. Integr Biol. 8 (3), 287-301 (2016).
- Pi, F., Dillard, P., Limozin, L., Charrier, A., Sengupta, K. Nanometric protein-patch arrays on glass and polydimethylsiloxane for cell adhesion studies. Nano lett. 13 (7), 3372-3378 (2013).
- Fenz, S. F., Merkel, R., Sengupta, K. Diffusion and intermembrane distance: case study of avidin and E-cadherin mediated adhesion. Langmuir. 25 (2), 1074-1085 (2009).
- Sengupta, K., et al. Mimicking tissue surfaces by supported membrane coupled ultra-thin layer of hyaluronic acid. Langmuir. 19 (5), 1775-1781 (2003).
- Taylor, Z. R., Keay, J. C., Sanchez, E. S., Johnson, M. B., Schmidtke, D. W. Independently controlling protein dot size and spacing in particle lithography. Langmuir. 28 (25), 9656-9663 (2012).
- Massou, S., et al. Large scale ordered topographical and chemical nano-features from anodic alumina templates. Appl. Surf Sci. 256 (2), 395-398 (2009).
- Selhuber-Unkel, C., Lopez-Garcia, M., Kessler, H., Spatz, J. P. Cooperativity in adhesion cluster formation during initial cell adhesion. Biophys J. 95 (11), 5424-5431 (2008).
- Arnold, M., et al. Induction of cell polarization and migration by a gradient of nanoscale variations in adhesive ligand spacing. Nano Lett. 8 (7), 2063-2069 (2008).
- Cavalcanti-Adam, E. A., et al. Cell spreading and focal adhesion dynamics are regulated by spacing of integrin ligands. Biophys J. 92 (8), 2964-2974 (2007).
- Schvartzman, M., et al. Nanolithographic Control of the Spatial Organization of Cellular Adhesion Receptors at the Single-Molecule Level. Nano Lett. 11 (3), 1306-1312 (2011).
- Mossman, K., Groves, J. Micropatterned supported membranes as tools for quantitative studies of the immunological synapse. Chem.Soc.Rev. 36 (1), 46-54 (2007).
- Furlan, G., et al. Phosphatase CD45 both positively and negatively regulates T cell receptor phosphorylation in reconstituted membrane protein clusters. J Biol Chem. 289 (41), 28514-28525 (2014).
- Hsu, C. J., et al. Ligand mobility modulates immunological synapse formation and T cell activation. PloS One. 7 (2), e32398 (2012).
- Yu, C., et al. Early integrin binding to Arg-Gly-Asp peptide activates actin polymerization and contractile movement that stimulates outward translocation. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20585-20590 (2011).
