Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica
Summary
Se presenta un protocolo para funcionalizar vidrio con parches de proteínas nanométricas rodeadas por una bicapa lipídica fluida. Estos sustratos son compatibles con el microscopio óptico avanzado y se espera que sirva como plataforma para los estudios de adhesión celular y la migración.
Abstract
Actualmente existe un gran interés en la creación de matrices ordenadas de islas de proteínas adhesivas en un mar de superficie neutralizada para estudios biológicos celulares. En los últimos años, se ha vuelto cada vez más claro que las células vivas responden, no sólo a la naturaleza bioquímica de las moléculas que se les presentan, sino también a la forma en que se presentan estas moléculas. La creación de proteínas micro-patrones tanto, es ahora estándar en muchos laboratorios de biología; nano-patrones son también más accesible. Sin embargo, en el contexto de interacciones célula-célula, hay una necesidad de patrón no sólo proteínas sino también bicapas lipídicas. Tal patrón de doble proteo-lipídica hasta ahora no ha sido fácil acceso. Ofrecemos una técnica fácil para crear proteínas nano-puntos apoyados sobre vidrio y proponer un método para rellenar el espacio entre puntos con una bicapa lipídica compatible (SLB). Desde foto-blanqueo de trazador lípidos fluorescentes incluyen en la SLB, se demuestra que la bicapa exhibe considerable en-plane fluidez. Funcionalización de los puntos de proteínas con grupos fluorescentes nos permite la imagen de ellos y demostrar que están ordenados en una red hexagonal regular. El tamaño típico de punto es de aproximadamente 800 nm y la separación demostrado aquí es de 2 micras. Se espera que estos sustratos para servir como plataformas útiles para la adhesión celular, la migración y estudios mecano-de detección.
Introduction
La adhesión celular se lleva a cabo a través de moléculas especializadas de adhesión celular (CAMs), las proteínas presentes en la membrana celular que son capaces de unirse a su contraparte en la matriz extracelular o en otra célula. En células adheridas, la mayoría de las moléculas de adhesión, incluyendo la integrina ubicua y cadherina, se encuentran en la forma de los grupos 1. La interacción de los linfocitos T (células T) con células presentadoras de antígeno (APCs) proporciona una ilustración particularmente notable de la importancia de grupos de receptores formados en la interfaz entre las dos células – menudo se llama una sinapsis inmunológica. Tras la formación de la primera contacto con los receptores de las células APC, T (TCR) en la superficie del encofrado de celdillas micras racimos escala T que sirven como señalización de las plataformas 2, 3, 4, y son finalmente centralizado para formar un clúster supramolecular central más grande (cSMAC )lass = "xref"> 5, 6, 7. Recientemente, se demostró que en el lado de APC, los ligandos de la TCR también se agrupan 8.
En el contexto de la interacción de células T-APC, el despliegue de sistemas híbridos, en el que el APC es imitado por una superficie artificial funcionalizado con proteínas relevantes, se ha avanzado en gran medida nuestra comprensión de la interfaz sináptica 2, 3, 4, 5, 6, 7 . En este contexto, es muy relevante para diseñar APC superficies miméticas que capturan uno o más aspectos de la célula diana. Por ejemplo, si los ligandos se injertan en bicapas lipídicas compatibles, que pueden difundirse en el plano de la bicapa, imitar la situación en la superficie de APC y al mismo tiempo permitir la formación de lacSMAC 6, 7. Del mismo modo, los racimos en la APC se han imitado mediante la creación de islas de ligandos en un mar de polímeros 9, 10, 11, 12, 13, 14. Sin embargo, estas dos características hasta ahora no han sido combinados.
Aquí se describe una nueva técnica para crear nano-puntos de anti-CD3 (un anticuerpo que se dirige el complejo TCR), rodeada por una bicapa lipídica con lípidos que se difunden. La bicapa se deposita usando Langmuir-Blodgett / Langmuir-Schaefer técnica 7, 15, 16 y si se desea, podría ser funcionalizada con una proteína específica – por ejemplo, el ligando de la integrina de células T (llamado ICAM1). Además, el anti-CD3 puntos de proteínas COUld ser reemplazado con otro anticuerpo o CAM. Si bien hemos elegido las proteínas para uso futuro como plataforma para los estudios de adhesión de células T, la estrategia se detalla aquí se puede adaptar para cualquier proteína e incluso ADN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos en el protocolo descrito anteriormente se relacionan con la formación de la proteína nano-puntos o la parte posterior de llenado del espacio alrededor de los puntos por una bicapa de lípidos compatible. El primer paso crítico con respecto a la proteína de nano-puntos es la preparación de la perla-máscara. La limpieza de la cubierta de corredera es crítica. Los portaobjetos necesitan ser limpiados o bien con una solución de detergente que se recomienda para la limpieza de cubetas de cuarzo, o…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Laurent Limozin, Pierre Dillard y Astrid Wahl para continuar un debate fructífero sobre aplicaciones celulares. Agradecemos también a Frederic Bedu desde las instalaciones de sala limpia PLANETE por su ayuda con las observaciones de SEM. Este trabajo fue financiado en parte por el Consejo Europeo de Investigación a través de la subvención Nº 307104 FP / 2007-2013 / CEI.
Materials
| Glass coverslips | Assistent, Karl Hecht KG | |
| Observation chamber | Home made | |
| Alkaline surfactant concentrate (Hellmanex) | Hella Analytics | 9-307-011-4-507 |
| Ultra-sonicator | ThermoFisher | |
| Desiccator | Labbox | |
| Crystallizer | Shott | |
| Neutravidine | Thermo Fischer Scientifique | 84607 |
| PBS | Sigma-aldrich | P3813 |
| Water MQ | ELGA, Veolia France | |
| Silica beads | Corpuscular Inc | 147114-10 |
| APTES | Sigma-aldrich | A3648 |
| BSA-Biotin | Sigma-aldrich | A8549 |
| DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| Dansyl-PE | Avanti Polar Lipids | 810330C |
| Chloroform | Sigma-aldrich | 650471 |
| Gastight syringe | Dominique Dustcher , France | 74453 |
| Film balance | NIMA | Medium |
| Microscope | Zeiss, Germany | TIRF-III system |
| Aluminium Target | Kurt J. Lesker Compagny, USA | |
| Radio Frequency Magnetron sputtering Système | modified SMC 600 tool by ALCATEL , France |
References
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