Shunt-Chirurgie, Rechtsherzkatheter und Gefäß Morphometry in einem Rattenmodell für Durchfluss-induzierte pulmonale arterielle Hypertonie
Summary
This protocol describes a surgical procedure to create a model for flow-induced pulmonary arterial hypertension (PAH) in rats and the procedures to analyze the principle hemodynamic and histological end-points in this model.
Abstract
In this protocol, PAH is induced by combining a 60 mg/kg monocrotalin (MCT) injection with increased pulmonary blood flow through an aorto-caval shunt (MCT+Flow). The shunt is created by inserting an 18-G needle from the abdominal aorta into the adjacent caval vein. Increased pulmonary flow has been demonstrated as an essential trigger for a severe form of PAH with distinct phases of disease progression, characterized by early medial hypertrophy followed by neointimal lesions and the progressive occlusion of the small pulmonary vessels. To measure the right heart and pulmonary hemodynamics in this model, right heart catheterization is performed by inserting a rigid cannula containing a flexible ball-tip catheter via the right jugular vein into the right ventricle. The catheter is then advanced into the main and the more distal pulmonary arteries. The histopathology of the pulmonary vasculature is assessed qualitatively, by scoring the pre- and intra-acinar vessels on the degree of muscularization and the presence of a neointima, and quantitatively, by measuring the wall thickness, the wall-lumen ratios, and the occlusion score.
Introduction
Das Ziel dieses Verfahrens ist es, ein reproduzierbares Modell für schwere, strömungsinduzierten pulmonaler arterieller Hypertonie in Ratten zu erzeugen und ihr Prinzip hämodynamischen und histopathologischen Endpunkte zu messen.
Pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) ist ein klinisches Syndrom, das eine progressive Zunahme des pulmonalen Gefässwiderstands führt zu Rechtsherzversagen und Tod umfasst. Innerhalb des übergeordneten Krankheitsspektrum der Lungenbluthochdruckerkrankungen (PH) ist PAH die schwerste Form und eine , die 1 ohne Heilung bleibt. Die zugrunde liegende Arteriopathie in PAH wird durch eine typische Form der Gefäßumbau gekennzeichnet, dass das Gefäßlumen verschliesst. Muskularisierung von normalen , nicht muskularisierte Gefäße und Hypertrophie des medialen Gefäßschicht als frühe Krankheitserscheinungen bei PAH angesehen werden, werden auch in anderen Formen der PH 2 und sind gedacht , gesehen 3 reversibel. Als PAH eindvances beginnt die Intima – Schicht umzubauen, schließlich charakteristische neointimalen Läsionen bilden 2. Neointima-Typ pulmonalen Gefäßumbau ist exklusiv für PAH und wird derzeit unumkehrbar 4 zu betrachten.
Als PAH eine seltene Krankheit ist, geht in seiner pathobiologischen Verständnis und Entwicklung von neuartigen Therapien haben sich stark auf Tiermodelle verlassen. Die monocrotalin (MCT) Modell bei Ratten ist ein einfaches Single – Hit – Modell , das war und ist immer noch, häufig verwendet. MCT ist ein Toxin , die eine Schädigung der Lungen Arteriolen und regionalen Entzündung 5 verursacht. 60 mg / kg MCT führt zu einer Erhöhung des mittleren Lungenarteriendruck (mPAP), pulmonaler vaskulärer Widerstand (PVR) und rechte ventrikuläre Hypertrophie (RVH) nach 3 – 4 Wochen 6. Die Histomorphologie wird durch isolierte mediale Hypertrophie ohne neointimalen Läsionen 5 gekennzeichnet. Der MCTso Rattenmodell stellt eine moderate Form von PH, und nicht die PAH, obwohl es allgemein als das letztere präsentiert wird.
Bei Kindern mit PAH in Verbindung mit angeborenem Links-Rechts – Shunt (PAH-CHD), erhöhte Lungenblutung als wesentliche Auslöser für die Entwicklung der neointimalen Läsionen 7, 8, 9 betrachtet wird. Bei Ratten erhöhte Lungenblutfluss kann durch die Schaffung eines Shunt zwischen der abdominalen Aorta und Vena cava, eine Technik erstmals 1990 beschrieben , 10 induziert werden. Alternativen erhöht zu schaffen Lungenfluss sind durch einseitige pneumonectomy oder durch subclavian zu Lungenarterie Anastomose 11. Conceptual Nachteile dieser Modelle bestehen aus Potentialausgleichs Wachstum der verbleibenden Lunge und adaptive Signalweg-Aktivierung durch die pneumonectomy induziert oder der iatrogenen Schädigung des Lungengefäßsystems durchzu Lungenarterie Anastomose, verwirrende sowohl die Auswirkungen der erhöhten Lungenblutung.
Wenn ein aorto-Kava-Shunt erzeugt und Lungenblutung erhöht wird als ein zweiter Treffer in MCT-behandelten Ratten induziert, treten charakteristische neointimalen Läsionen und eine schwere Form der PAH und Rechtsherzversagen assoziiert (RVF) entwickeln 3 Wochen nach der erhöhten 12 strömen. Die hämodynamische Progression von PAH in diesem Modell kann in vivo durch Echokardiographie und Rechtsherzkatheter zu beurteilen. Das vaskuläre Histomorphologie, Gefäßwanddicke, dem Grad der arteriolar Okklusion und Parameter für Rechtsherzversagen bilden die Säulen der ex vivo Charakterisierung von PAH.
Diese Methode beschreibt detaillierte Protokolle für die aorto-Kava-Shunt (AC-Shunt) Chirurgie, Rechtsherzkatheter und qualitative und quantitative Bewertung der vaskulären Histomorphologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Verfahren beschreibt das chirurgische Verfahren eines aorto-Kava-Shunt bei Ratten mit MCT vorbehandelt strömungsinduzierten PAH und die Techniken zu schaffen, das Prinzip hämodynamischen und histopathologischen Endpunkte zu bewerten, die PAH und dieses Modell zu charakterisieren.
Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls und Fehlerbehebung
Chirurgie und nach der Operation. Während der aorto-Kava-Shunt-Chirurgie, der wichtigste Schritt ist die Dissektion …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by the Netherlands Cardiovascular Research Initiative, the Dutch Heart Foundation, the Dutch Federation of University Medical Centers, the Netherlands Organization for Health Research and Development, and the Royal Netherlands Academy of Sciences (CVON nr. 2012-08, PHAEDRA, The Sebald fund, Stichting Hartekind).
Materials
|
Shunt Surgery |
|||
| Sterile surgical gloves | |||
| Duratears Eye ointment | Alcon | 10380 | |
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Histoacryllic tissue glue | B. Braun Medical | 1050052 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Safil 4-0 sutures violet resorbable | B. Braun Medical | ||
| 18 G needle | Luer | NN1838R BD | tip bent in 45 degrees orifice to the outside |
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Temgesic Buprenorphine | RB Pharmaceuticals | 5429 | subcutaneous injection |
| Sodium Chloride 0.9 % | |||
| Ventilation mask Rat | |||
| Scalple blade | |||
| Biemer clamp 18 mm, 5 mm opening | AgnTho | 64-562 | |
| Heat mat | |||
| Kocher Clamp | |||
| Shaving machine | |||
| Microscope | Leica | ||
|
Right Heart Catheterization |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile surgical gloves | |||
| Eye ointment | Duratears | ||
| Chloride-Hexidine | |||
| Cotton swabs | |||
| Gauzes 10×10 cm | Paul Hartmann | 407825 | |
| Silkam 5-0 sutures black non-resorbable | B. Braun Medical | F1134027 | |
| Needle 20 G | Luer | Tip slightly bent to the inside | |
| Cannula 20 G | Luer | to introduce catheter, tip pre-formed in 20 degrees | |
| Silastic Catheter 15 cm long | 0.5 mm ball 2 mm from tip | ||
| Pressure transducer | Ailtech | ||
| Bedside monitor Cardiocap/5 | Datex-Ohmeda | ||
| Shaving machine | |||
| 10mL Syringe | |||
| Sodium Chloride 0.9 % | for flushing | ||
|
Vascular Morphology |
|||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50ml Syringe | |||
| 4 % Formaldehyde | |||
| 18 G cannula with tube | |||
| Verhoef staining kit | Sigma-Aldrich | HT254 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/ht254?lang=en®ion=US |
| Digital slide scanner | Hamamatsu | C9600 | |
| Image-J | |||
| Elastic (Connective Tissue Stain) | Abcam | ab150667 | http://www.abcam.com/elastic-connective-tissue-stain-ab150667.html |
| http://www.abcam.com/ps/products/150/ab150667/documents/ab150667-Elastic%20Stain%20Kit%20(website).pdf |
References
- Hoeper, M. M., Bogaard, H. J., Condliffe, R., et al. Definitions and diagnosis of pulmonary hypertension. J Am Coll Cardiol. 62, D42-D50 (2013).
- Stacher, E., Graham, B. B., Hunt, J. M., et al. Modern age pathology of pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Crit Care Med. 186 (3), 261-272 (2012).
- Levy, M., Maurey, C., Celermajer, D. S., et al. Impaired apoptosis of pulmonary endothelial cells is associated with intimal proliferation and irreversibility of pulmonary hypertension in congenital heart disease. J Am Coll Cardiol. 49 (7), 803-810 (2007).
- Sakao, S., Tatsumi, K., Voelkel, N. F. Reversible or irreversible remodeling in pulmonary arterial hypertension. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 629-634 (2010).
- Gomez-Arroyo, J. G., Farkas, L., Alhussaini, A. A., et al. The monocrotaline model of pulmonary hypertension in perspective. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (4), L363-L369 (2012).
- Jones, J. E. Serial noninvasive assessment of progressive pulmonary hypertension in a rat model. Am J Physiol – Heart Circ Physiol. 283 (1), 364-371 (2002).
- Hoffman, J. I., Rudolph, A. M., Heymann, M. A. Pulmonary vascular disease with congenital heart lesions: Pathologic features and causes. Circulation. 64 (5), 873-877 (1981).
- van Albada, M. E., Berger, R. M. Pulmonary arterial hypertension in congenital cardiac disease–the need for refinement of the evian-venice classification. Cardiol Young. 18 (1), 10-17 (2008).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Borgdorff, M. A., Berger, R. M. The role of disturbed blood flow in the development of pulmonary arterial hypertension: Lessons from preclinical animal models. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 305 (1), L1-L14 (2013).
- Garcia, R., Diebold, S. Simple, rapid, and effective method of producing aortocaval shunts in the rat. Cardiovasc Res. 24 (5), 430-432 (1990).
- Okada, K., Tanaka, Y., Bernstein, M., Zhang, W., Patterson, G. A., Botney, M. D. Pulmonary hemodynamics modify the rat pulmonary artery response to injury. A neointimal model of pulmonary hypertension. Am J Pathol. 151 (4), 1019-1025 (1997).
- van Albada, M. E., Schoemaker, R. G., Kemna, M. S., Cromme-Dijkhuis, A. H., van Veghel, R., Berger, R. M. The role of increased pulmonary blood flow in pulmonary arterial hypertension. Eur Respir J. 26 (3), 487-493 (2005).
- Brittain, E. Echocardiographic assessment of the right heart in mice. JVis Exp. (e81), (2013).
- Dickinson, M. G., Bartelds, B., Molema, G., et al. Egr-1 expression during neointimal development in flow-associated pulmonary hypertension. Am J Pathol. 179 (5), 2199-2209 (2011).
- Borgdorff, M. A., Bartelds, B., Dickinson, M. G., Steendijk, P., de Vroomen, M., Berger, R. M. Distinct loading conditions reveal various patterns of right ventricular adaptation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 305 (3), H354-H364 (2013).
- Ruiter, G., de Man, F. S., Schalij, I., et al. Reversibility of the monocrotaline pulmonary hypertension rat model. Eur Respir J. 42 (2), 553-556 (2013).
- van Albada, M. E., Bartelds, B., Wijnberg, H., et al. Gene expression profile in flow-associated pulmonary arterial hypertension with neointimal lesions. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (4), L483-L491 (2010).
- Dickinson, M. G., Kowalski, P. S., Bartelds, B., et al. A critical role for egr-1 during vascular remodelling in pulmonary arterial hypertension. Cardiovasc Res. 103 (4), 573-584 (2014).
- van der Feen, D. E., Dickinson, M. G., Bartelds, M. G., et al. Egr-1 identifies neointimal remodeling and relates to progression in human pulmonary arterial hypertension. Jheart lung transplant. 35 (4), 481-490 (2016).
- Rungatscher, A. Chronic overcirculation-induced pulmonary arterial hypertension in aorto-caval shunt. Microvasc Res. 94, 73-79 (2014).
- O’Blenes, S. B., Fischer, S., McIntyre, B., Keshavjee, S., Rabinovitch, M. Hemodynamic unloading leads to regression of pulmonary vascular disease in rats. J Thorac Cardiovasc Surg. 121 (2), 279-289 (2001).
- Sakao, S., Taraseviciene-Stewart, L., Lee, J. D., Wood, K., Cool, C. D., Voelkel, N. F. Initial apoptosis is followed by increased proliferation of apoptosis-resistant endothelial cells. FASEB J. 19 (9), 1178-1180 (2005).
- Spiekerkoetter, E. FK506 activates BMPR2, rescues endothelial dysfunction, and reverses pulmonary hypertension. J Clin Invest. 123 (8), 3600-3613 (2013).
- Nickel, N. P., Spiekerkoetter, E., Gu, M., et al. Elafin reverses pulmonary hypertension via caveolin-1-dependent bone morphogenetic protein signaling. Am J Respir Crit Care Med. 191 (11), 1273-1286 (2015).
- Meloche, J., Potus, F., Vaillancourt, M., et al. Bromodomain-containing protein 4: The epigenetic origin of pulmonary arterial hypertension. Circ Res. 117 (6), 525-535 (2015).
- Happé, C. M. Pneumonectomy combined with SU5416 induces severe pulmonary hypertension in rats. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 310 (11), L1088-L1097 (2016).
- Ranchoux, B., Antigny, F., Rucker-Martin, C., et al. Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension. Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).
- de Raaf, M. A. SuHx rat model: Partly reversible pulmonary hypertension and progressive intima obstruction. Eur Respy J. 44 (1), 160-168 (2014).
