Kortlægning af bindingssted en aptamer på ATP Brug mikroskala Thermophoresis

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Abstract

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Introduction

Interaktion mellem molekyler er grundlaget for naturen. Derfor forskere i mange områder af grundforskning og anvendt forskning forsøge at forstå de grundlæggende principper om molekylære interaktioner af forskellig art. Individuel Thermophoresis (MST) gør det muligt for forskere at udføre hurtig, præcis, omkostningseffektiv, og kvalitet-kontrollerede karakterisering af molekylære interaktioner i opløsning, med frit valg af buffere. Der er allerede mere end 1.000 publikationer MST, fra 2016 alene, der beskriver forskellige former for analyser, herunder bibliotekets screeninger, bindende event valideringer, konkurrence analyser og eksperimenter med flere bindende partnere ^1-8. Generelt MST tillader studiet af de klassiske bindende parametre, såsom bindingsaffinitet (pM til mM), støkiometri og termodynamik, af enhver form for molekylær interaktion. En stor fordel ved MST er evnen til at studere bindingsbegivenheder uafhængigt af størrelsen af ​​de interaktionspartnere. Selv udfordrende interaktioner mellem små nucleinsyre aptamerer (15-30 nt) og mål såsom små molekyler, lægemidler, antibiotika eller metabolitter kan kvantificeres.

Aktuelle state-of-the-art teknologier til at karakterisere aptamer målgruppen interaktioner er enten lab-intens og meget komplekse eller undlader at kvantificere aptamer-lille molekyle interaktioner ^9,10. Surface (SPR) -baserede assays ^11,12 og virkelig label-fri kalorimetriske tilgange, såsom Isotermisk Titrering kalorimetri (ITC) ^13-15, isokratisk eluering ^16, ligevægt fi ltrering ^17,18, in-line sondering ^19, gel- skift analyser, stopped- fl ow fl uorescence spektroskopi ^20,21, fluorescens anisotropi (FA) ^22,23, single-molekyle fl uorescence billedbehandling ^24,25, og Bio-lags interferometri (BLI) ²⁶ er også enten upræcise eller uforenelig med aptamer-lille molekyle interaktioner. Andre principal spørgsmål af disse metoder er lav følsomhed, højt forbrug prøve, immobilisering, masse begrænsninger transport på overflader, og / eller buffer restriktioner. Kun få af disse teknologier giver integrerede styringer til sammenlægning og adsorption effekter.

MST er et effektivt redskab for forskerne at overvinde denne begrænsning for at undersøge samspillet mellem aptamerer og små molekyler ^27-29, samt andre mål, såsom proteiner ^30-33. Teknologien bygger på flytning af molekyler gennem temperaturgradienter. Denne rettet bevægelse, kaldet "thermophoresis," afhænger af størrelse, ladning, og hydrering skallen af molekylet ^34,35. Bindingen af ​​en ligand til molekylet vil direkte ændre mindst en af ​​disse parametre, hvilket resulterer i en ændret thermophoretic mobilitet. Ligander med små størrelser kan ikke have en betydelig indvirkning i form af størrelse ændring fra den ubundne til den bundne tilstand, men de kan have dr amatic virkninger på hydrering skal og / eller beregning. Ændringerne i thermophoretic bevægelse af molekyler efter interaktioner med bindingspartneren muliggør kvantificering af grundlæggende bindingsparametre ^{2,7,34,36,37.}

Som afbildet i figur 1A, MST anordning består af en infrarød laser fokuseres på prøven inden for de glaskapillarer anvendelse af de samme optikker som for fluorescens detektion. Kan overvåges thermophoretic bevægelse af proteiner via den iboende fl uorescence af tryptophaner ⁶ eller af en fluorescens-mærket interaktion partner ^3,8, mens laseren etablerer en temperaturgradient (AT på 2-6 ° C). Den resulterende temperaturforskel i rummet, AT, fører til udtømning eller akkumulering af molekyler i området for forhøjet temperatur, som kan kvantificeres ved Soret fi cient (S _T):

g "/>

c _varmt repræsenterer koncentrationen i den opvarmede region, og C _Kold er koncentrationen i den indledende koldt region.

Som vist i figur 1B, en typisk MST eksperimentresultaterne i en MST bevægelse profil (tidssporet), der består af forskellige faser, som kan adskilles ved deres respektive tidsplaner. Den indledende fluorescens måles i de første 5 s i fravær af temperaturgradienten at definere den præcise start fluorescens og for at kontrollere for fotoblegning eller photoenhancement. Temperaturen Jump (T-jump) repræsenterer den fase, hvor fluorescens ændringer før thermophoretic bevægelse. Denne indledende fald i fluorescens afhænger varme-afhængige ændringer i fl uorophore kvantumudbytte. Den thermophoresis fase følger, hvor fluorescens falder (eller stiger) på grund af den thermophoretic bevægelse af molekylerne indtil steady-state fordelingen er nået.Kan observeres den omvendte TJump og samtidig tilbagediffusion af fl uorescent molekyler som vist i figur 1 B, efter at laseren er slukket. For at få adgang grundlæggende bindende parametre, er forskellige molære forhold af interaktionspartnere analyseret og sammenlignet. Typisk er 16 forskellige forhold undersøgt i en MST eksperiment, hvorimod den optiske synlige molekyle holdes konstant og leveres med en stigende mængde af umærket ligand. Samspillet mellem de to bindende partnere inducerer ændringer i thermophoresis, og dermed i det normaliserede fl uorescence, F _norm, der beregnes som følger:

F _varmt og F _koldt repræsenterer gennemsnit fl uorescence intensiteter på defineret tidspunkter af MST spor. Bindingsaffiniteter (K _d eller EC ₅₀ værdier) kan beregnes ved Curve fitting (figur 1C).

Samlet set MST er et stærkt værktøj til at studere molekylære interaktioner af nogen art. Dette håndskrift tilbyder en protokol til at karakterisere udfordrende samspil mellem det lille molekyle adenosin trifosfat (ATP, 0,5 kDa) og 25-nt kort ssDNA aptamer DH25.42 (7,9 kDa). I løbet af manuskriptet, er bindingsstedet for aptameren på ATP-molekylet kortlagt ned til adenin gruppe af ATP.

Protocol

1. Fremstilling af aptameren arbejdslager Følg producentens anvisninger og opløse oligonukleotidet (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekvens fra henvisning 18) i vand, når en 100-uM endelig koncentration. Forbered aptamer arbejdsopløsning ved fortynding af oligonukleotidet lager til 200 nM med bindingsbuffer (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCI; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween20). Inkuber blandingen i 2 minutter ved 90 ° C, lad prøven straks køle ned på is, og bruge pr…

Representative Results

I denne undersøgelse blev MST anvendt til at karakterisere bindingssted DH25.42 DNA aptamer 18 på ATP. I modsætning til andre undersøgelser kendetegner interaktionen af ATP eller ATP-efterlignende små molekyler med proteiner tilfældigt mærket med en eller flere fluoroforer 38-40, denne undersøgelse omfatter en mærket version af 7,9 kDa ssDNA aptamer med én Cy5 molekyle på 5'enden . Forskellige ATP derivater og beslægtede molekyler, der alle er forske…

Discussion

Kvalitet kontrol:

Uspecifik fastklæbning / adsorption af prøvemateriale til overflader, samt aggregering effekter, har en dramatisk indflydelse på kvaliteten af ​​de affinitet data. Men kun få state-of-the-art teknologier giver præcise og hurtige muligheder for at overvåge og undgå disse effekter. MST tilbyder integrerede kvalitetskontroller, der registrerer og bidrage til at overvinde disse problemer, der giver mulighed for trinvis optimering af tekniske setup. Vigtig information om…

Materials

Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software