Kartläggning av bindningsstället för en aptamer på ATP Använda Micro Thermophoresis

Summary

MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive technology to characterize aptamer-target interactions. This manuscript describes an MST protocol to characterize aptamer-small molecule interactions.

Abstract

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an essential step in basic and applied science. MicroScale Thermophoresis (MST) is a sensitive biophysical method to obtain this important information. Relying on a physical effect called thermophoresis, which describes the movement of molecules through temperature gradients, this technology allows for the fast and precise determination of binding parameters in solution and allows the free choice of buffer conditions (from buffer to lysates/sera). MST uses the fact that an unbound molecule displays a different thermophoretic movement than a molecule that is in complex with a binding partner. The thermophoretic movement is altered in the moment of molecular interaction due to changes in size, charge, and hydration shell. By comparing the movement profiles of different molecular ratios of the two binding partners, quantitative information such as binding affinity (pM to mM) can be determined. Even challenging interactions between molecules of small sizes, such as aptamers and small compounds, can be studied by MST. Using the well-studied model interaction between the DH25.42 DNA aptamer and ATP, this manuscript provides a protocol to characterize aptamer-small molecule interactions. This study demonstrates that MST is highly sensitive and permits the mapping of the binding site of the 7.9 kDa DNA aptamer to the adenine of ATP.

Introduction

Interaktion mellan molekyler utgör grunden för naturen. Därför forskare inom många områden av grundforskning och tillämpad forskning försöker förstå de grundläggande principerna för molekylära interaktioner av olika slag. Micro Thermophoresis (MST) gör det möjligt för forskare att utföra snabba, exakta och kostnadseffektiva, och kvalitetskontrollerad karakterisering av molekylära interaktioner i lösning, med ett fritt val av buffertar. Det finns redan mer än 1.000 publikationer med hjälp av MST, från 2016 ensam, som beskriver olika typer av analyser, inklusive biblioteks filmvisningar, bindande händelse valideringar, konkurrensanalyser och experiment med flera bindningspartner ^1-8. I allmänhet, MST tillåter studiet av de klassiska bindningsparametrar, såsom bindningsaffinitet (pM till mM), stökiometri, och termodynamik, av något slag av molekylär interaktion. En stor fördel med MST är förmågan att studera bindningshändelser oberoende av storleken av interaktionspartners. även chalnande interaktioner mellan små nukleinsyra aptamers (15-30 nt) och mål såsom små molekyler, läkemedel, antibiotika, eller metaboliter kan kvantifieras.

Nuvarande state-of-the-art teknik för att karakterisera aptamer-mål interaktioner är antingen lab-intensiv och mycket komplexa eller misslyckas med att kvantifiera aptamer-småmolekylära interaktioner ^9,10. Surface Plasmon Resonance (SPR) -baserad analyser ^11,12 och verkligen etikettfria kalorimetriska metoder, såsom Isotermiska Titrering Calorimetry (ITC) ^13-15, isokratisk eluering ^16, jämvikts fi ltration ^17,18, in-line sondering ^19, gel- skift analyser stopped- fl öde fl uorescence spektroskopi ^20,21, fluorescensanisotropi (FA) ^22,23, enda molekyl fl uorescence avbildning ^24,25, och Bio-skikt interferometri (BLI) ²⁶ är också antingen oprecisa eller oförenlig med aptamer-liten molekyl interaktioner. andra huvl frågor dessa metoder är låg känslighet, hög prov konsumtion, immobilisering, begränsningar masstransport på ytor, och / eller begränsningar buffert. Endast ett fåtal av dessa tekniker ger integrerade kontroller för aggregering och adsorption effekter.

MST utgör ett kraftfullt verktyg för forskare att övervinna denna begränsning för att studera samspelet mellan aptamers och små molekyler ^27-29, liksom andra mål såsom proteiner ^30-33. Tekniken bygger på förflyttning av molekyler genom temperaturgradienter. Detta riktad rörelse, kallad "thermophoresis" beror på storlek, laddning, och hydrering skal av molekylen ^34,35. Bindningen av en ligand till molekylen kommer att direkt förändra åtminstone en av dessa parametrar, vilket resulterar i ett förändrat thermophoretic rörlighet. Ligander med små storlekar kan inte ha en betydande inverkan i termer av storlek förändring från den obundna till det bundna tillståndet, men de kan ha dr amatic effekter på vätske skal och / eller laddning. Förändringarna i thermophoretic rörelse av molekyler efter växelverkan med bindningspartnern möjliggör kvantifiering av grundläggande bindningsparametrar ^{2,7,34,36,37.}

Såsom avbildas i figur 1 A, MST Anordningen består av en infraröd laser fokuseras på provet inom de glaskapillärer med användning av samma optik som för fluorescensdetektion. Den thermophoretic rörelsen av proteiner via den inre fl uorescence av tryptofaner ⁶ eller av en fluorescensmärkt interaktionspartner ^3,8 kan övervakas medan lasern upprättas en temperaturgradient (AT för 2-6 ° C). Den resulterande temperaturskillnaden i rymden, AT, leder till utarmning eller ackumulering av molekyler i området för förhöjd temperatur, som kan kvantifieras genom det Soret koef fi räcklig (S _T):

g "/>

c _hett representerar koncentrationen i det uppvärmda området, och c _kallt är koncentrationen i det inledande kall regionen.

Såsom visas i figur 1B, en typisk MST experimentresultat i en MST rörelseprofil (tidskurva), som består av olika faser, vilka kan separeras med deras respektive tidsskalor. Den initiala fluorescens mäts i de första 5 si frånvaro av temperaturgradienten att definiera exakt börjar fluorescens och för att kontrollera fotoblekning eller photoenhancement. Temperatur Jump (T-Jump) representerar fas där fluorescens ändringarna innan thermophoretic rörelse. Denna inledande minskning i fluorescens beror på värmeberoende förändringar av fl uorophore kvantutbyte. Den thermophoresis fas följer, i vilken fluorescens minskar (eller ökar) på grund av den thermophoretic rörelsen av molekylerna tills steady-state distributions uppnås.Kan observeras omvända TJump och samtidig tillbaka diffusion av fl uorescent molekyler som visas i figur 1B efter lasern är avstängd. För att få tillgång grundläggande bindningsparametrar används olika molära förhållanden av interaktionspartners analyseras och jämföras. Normalt är 16 olika förhållanden studerats i en MST experiment, medan den optiska synlig molekylen hålls konstant och matas med en ökande mängd av omärkt ligand. Samspelet mellan de två bindningspartners framkallar förändringar i thermophoresis, och därmed i den normaliserade fl uorescence, F _norm, som beräknas enligt följande:

F _varm och F _kall representerar genomsnitt fl uorescence intensiteter vid de fi nierade punkter i MST spåren gång. Bindningsaffiniteter (K _d eller EC _50-värden) kan beräknas genom curve montering (Figur 1C).

Totalt sett är MST ett kraftfullt verktyg för att studera molekylära interaktioner av något slag. Detta manuskript ger ett protokoll för att karakterisera utmanande samverkan mellan den lilla molekylen adenosintrifosfat (ATP, 0,5 kDa) och 25-nt kort ssDNA aptamer DH25.42 (7,9 kDa). Under loppet av manuskriptet, är bindningsstället för aptameren på ATP-molekylen mappas ner till adenin grupp av ATP.

Protocol

1. Beredning av aptamer Working Stock Följ tillverkarens instruktioner och lös oligonukleotid (5-Cy5-CCTG GGGGAGTATTGCGGAGGAAGG-3, sekvens från 18 referens) i vatten, och nådde en 100-iM slutkoncentration. Förbered aptamer arbetslösning genom spädning av oligonukleotiden lager till 200 nM med bindningsbuffert (20 mM Tris, pH 7,6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0,01% Tween 20). Inkubera blandningen under 2 min vid 90 ° C, låt provet kallna omedelbart ned på is, och…

Representative Results

I denna studie var MST tillämpas för att karakterisera bindningsstället av DH25.42 DNA aptamer 18 på ATP. I motsats till andra studier som kännetecknar interaktionen av ATP eller ATP-mimicking små molekyler med proteiner slumpvis märkta med en eller flera fluoroforer 38-40, innefattar denna studie en märkt version av 7,9 kDa ssDNA aptamer med en Cy5 molekyl på 5'-änden . Olika ATP-derivat och besläktade molekyler, som alla skiljer sig från ATP i olik…

Discussion

Kvalitetskontroller:

Ospecifik klibbning / adsorption av provmaterial till ytor, liksom aggregering effekter, har en dramatisk inverkan på kvaliteten av de affinitetsdata. Men bara några state-of-the-art teknik erbjuder noggranna och snabba möjligheter att övervaka och undvika dessa effekter. MST erbjuder integrerade kvalitetskontroller som upptäcker och bidrar till att övervinna dessa frågor, gör det möjligt att stegvis optimering av den tekniska installationen. Viktig information om …

Materials

Aptamer binding buffer			20 mM Tris pH7.6; 300 mM NaCl; 5 mM MgCl2; 0.01%Tween-20
Fluorescently labeled ATP aptamer	IDT, Leuven, Belgium		sequence: DH25.42 50-Cy5-CCTGGGGGAGT- ATTGCGGAGGAAGG-3
ATP	Sigma Aldrich, Germany	A2383	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
ADP	Sigma Aldrich, Germany	A2754	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
AMP	Sigma Aldrich, Germany	A2252	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Adenine	Sigma Aldrich, Germany	A8626	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
SAM	Sigma Aldrich, Germany	A7007	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
dATP	Sigma Aldrich, Germany	11934511001	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
CTP	Sigma Aldrich, Germany	C1506	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
GTP	Sigma Aldrich, Germany	G8877	10 mM stock solutions stored at – 20 °C
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-G008	Blue/Red Channel MST device with standard detector, Monolith NT115 pico is MST device with high sensitivity detector
Monolith NT.115 capillaries Standard	NanoTemper Technologies, Munich, Germany	MO-K002
Eppendorf PCR tubes	Eppendorf, Germany	30124537
Monolith control software. 2.1.33, pre-installed on the device	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
MO.affinity analysis v2.1.1	NanoTemper Technologies, Munich, Germany
Kaleidagraph 4.5.2	Synergy Software