マウス同所性膀胱腫瘍モデルおよび腫瘍検出システム
Summary
このプロトコルは、雌のC57BL / 6Jマウスにおけるマウス同所性膀胱腫瘍の発生および腫瘍増殖の監視について説明します。
Abstract
このプロトコルは、ヒト前立腺特異抗原（PSA）、および腫瘍移植の確認のための手続きを分泌するように改変されたマウス膀胱癌細胞株MB49を使用して、雌C57BL / 6Jマウスに膀胱腫瘍の発生について記載しています。簡潔には、マウスは、注射可能な薬剤を使用して麻酔し、仰臥位に配置するために形成されています。尿が膀胱から空いており、ポリ-L-リジン（PLL）の50μLをゆっくりと24 G IVカテーテルを用いて、10μL/ 20秒の速度で滴下します。これは、カテーテルを栓により20分間膀胱内に残されています。カテーテルを除去し、PLLは、膀胱に優しい圧力で空きました。これは、10μL/ 20秒の速度でマウス膀胱癌細胞株（1×10 5細胞/ 50μL）の注入が続きます。カテーテルは、早期の避難を防止するために栓をされています。 1時間後、マウスを反転薬物と復活され、膀胱が空にされます。遅い点滴速度が重要であり、それは腫瘍が上部尿路に、腎臓に発生させることができます膀胱・尿管逆流を減少させるので。細胞株は、よく、これは移植後凹凸腫瘍サイズをもたらすことができるように、細胞の凝集を減少させるために再懸濁されるべきです。
この技術は、高効率で腫瘍を誘導します。腫瘍の成長は、尿中のPSA分泌によって監視されています。 PSAマーカーのモニタリングは、膀胱内の腫瘍の存在を検出するための超音波又は蛍光イメージングよりも信頼性が高いです。放置すれば4週間 – マウスの腫瘍は、一般に、約3により最大サイズ悪影響を与える健康に達します。腫瘍増殖をモニタリングすることによって、正常に腫瘍を移植されなかったものから硬化したマウスを区別することが可能です。唯一のエンドポイント分析を用いて、後者は、誤って治療することによって硬化されていると仮定することができます。
Introduction
この方法の目的は、腫瘍移植なしのマウスは、エンドポイント分析で硬化されたと考えられないように、マウス同所性膀胱腫瘍を生成し、可能な限り正確に移植された腫瘍を監視することです。全体として、示された方法は、実験的な分析のためにマウスの多くの必要性を低減し、治療結果を決定する際に高い精度を確保します。
注入し、腫瘍細胞を皮下臨床疾患の環境を再現または治療戦略の開発を可能にしないように癌の同所性モデルの開発は、重要です。膀胱のアーキテクチャは、直接、最小限の全身作用を持つ膀胱に膀胱癌治療の点滴注入を可能にします。したがって、例えば、同所性モデルとして、この環境を再現する動物モデルは、新しい治療法を評価することが重要です。いずれの実験のセットアップから引き出された結論はdependenされていますモデルの限界時のトン。
いくつかの技術は、マウスにおける同所性膀胱腫瘍の産生のために開発されてきました。これらは、膀胱のグリコサミノグリカン層を損傷注入する腫瘍細胞を有効に頼ります。使用される技術は、膀胱1,2内の1つのサイトで、腫瘍の発生につながる、膀胱壁に損傷の一点につながる電気焼灼を含みます。しかし、電気メスを用いた腫瘍移植の成功率は、オペレータに依存10から変化している – 90％、およびそれが腹腔内現像腫瘍を引き起こす、膀胱壁がパンクする危険性を含みます。化学焼灼は硝酸銀、損傷膀胱壁3を用いて行われます。同様に、酸は、膀胱壁4を損傷するために使用されています。トリプシンはまた、ウェル5のように、膀胱に損傷を与えるために使用されています。これらの方法は、膀胱内の複数の腫瘍の発達をもたらすことができます。化学物質は長すぎるために膀胱壁に接触して残っている場合はさらに、膀胱に重大な損傷の危険性があります。 Ninalga らによって開発された方法。正に帯電したポリ-L-リジン（PLL）被覆膀胱壁への6分子を使用します。これは、膀胱のグリコサミノグリカン層に固執する負に帯電した腫瘍細胞を可能にします。この方法は、一般に、膀胱内に開発複数の腫瘍を生じるが、腫瘍移植80である- 100％の4,7。技術的には、また、実行するための最も簡単な手順です。開発腫瘍があってもサイズがかなりあることを確実にするために、腫瘍細胞は、移植前に大きな塊にグループ化されていないことが重要です。
治療効果を評価するためには、かなり類似したサイズの腫瘍を有するマウスにこの研究を実行するのが最善です。したがって、すぐに移植後に腫瘍の大きさを定量化することができ、良好な検出システムは、重要です。いくつかの戦略は、蜂を持っていますn個の腫瘍を評価するために使用されます。これらは、磁気共鳴イメージング（MRI）8-10、蛍光11、生物発光12,13、超音波14、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）15,16を含みます。 MRIと超音波が腫瘍細胞の改変を必要としないが、MRIのために敏感な機器およびコントラスト剤が必要とされています。 luminescence-、蛍光 – 、およびELISAベースのアッセイは、これらの方法によって検出することができるマーカータンパク質を発現する腫瘍細胞の改変を必要とします。発光のために、基板は、ルシフェラーゼ活性の検出のために必要とされます。このように、追加されたステップおよびコストの増大があります。発光と蛍光の両方が特殊な装置を必要とします。蛍光を生成するために、分子酸素によって触媒される緑色蛍光タンパク質（GFP）の環化は、必要とされます。このように、GFP発現は、このかなり信頼性の低いマーカー作り、酸素へのアクセスに応じて、腫瘍塊内で可変であってもよいです<sup> 17。代用マーカーとして、ヒト前立腺特異抗原（PSA）15,16を分泌するマウス膀胱癌細胞株MB49の変更は、別の戦略です。これらのマーカーはまた、実験の終了時に、腫瘍の存在を確認し、それらを免疫組織化学の代替を製造する代替手段を提供します。この研究は、同所腫瘍移植のPLL方式を報告し、腫瘍の検出システム、すなわちELISA、蛍光、および超音波イメージングの比較を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの中で最も重要なステップは、1）が正常細胞株の腫瘍形成性を維持しています。 2）マウスにおける腫瘍細胞移植の前に測定可能なPSAの分泌を確実。腫瘍の大きさのばらつきを低減するように、3）移植のための単一細胞懸濁液を生成します。そして4）腎臓における腫瘍細胞移植の結果、膀胱尿管逆流を防止するために、遅い速度で細胞を浸透させます。
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Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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