Un tumore modello murino ortotopico della vescica e del tumore Detection System
Summary
Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica ortotopico murini in femmine C57BL 6J e il monitoraggio della crescita tumorale /.
Abstract
Questo protocollo descrive la generazione di tumori della vescica in topi C57BL / 6J femmina utilizzando la linea cellulare di cancro alla vescica murino MB49, che è stato modificato a secernere prostatico umano specifico (PSA), e la procedura per la conferma di impianto del tumore. In breve, i topi vengono anestetizzati con farmaci iniettabili e sono fatti per porre in posizione di dorsale. L'urina è liberata dalla vescica e 50 ml di poli-L-lisina (PLL) viene lentamente instillato ad una velocità di 10 microlitri / 20 s utilizzando un catetere 24 G IV. Si lascia in vescica per 20 min in tappatura catetere. Il catetere viene rimosso e PLL è lasciata libera entro una leggera pressione sulla vescica. Questa è seguita da instillazione della linea cellulare di cancro alla vescica murino (1 x 10 5 cellule / 50 mL) ad una velocità di 10 ml / 20 s. Il catetere viene tappo per evitare evacuazione prematura. Dopo 1 h, i topi sono fatti rivivere con un farmaco inversione, e la vescica è liberate. Il tasso di instillazione lento è importante,poiché riduce il reflusso vescico-ureterale, che può causare tumori a verificarsi nel tratto urinario superiore e nei reni. La linea cellulare dovrebbe essere ben risospeso per ridurre aggregazione di cellule, come questo può portare a dimensioni tumorali irregolari dopo l'impianto.
Questa tecnica induce tumori con elevata efficienza. La crescita del tumore è monitorato da urinario secrezione di PSA. monitoraggio marcatore PSA è più affidabile di ultrasuoni o la fluorescenza per la rilevazione della presenza di tumori nella vescica. I tumori nei topi generalmente raggiungono una dimensione massima che influisce negativamente la salute di circa 3 – 4 settimane, se non trattata. Monitorando la crescita tumorale, è possibile differenziare topi che sono stati curati da quelli che non sono stati impiantati con successo con tumori. Con solo l'analisi end-point, quest'ultimo può essere erroneamente assume che sono stati curati con la terapia.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di generare tumori della vescica murino ortotopiche e di monitorare i tumori impiantati con la massima precisione possibile, in modo che i topi senza l'impianto del tumore non è pensato per essere trattato ad analisi end-point. In generale, il metodo mostrato ridurrà la necessità di un gran numero di topi per analisi sperimentale e garantire una maggiore precisione nel determinare risultati terapeutici.
Lo sviluppo di un modello ortotopico per il cancro è importante, in quanto le cellule tumorali impiantare sottocute non ricapitolano l'ambiente della malattia clinica o consentire lo sviluppo di strategie terapeutiche. L'architettura della vescica permette l'instillazione di terapie del cancro della vescica direttamente nella vescica con effetti sistemici minimi. Così, i modelli animali che ricapitolano questo ambiente, come un modello ortotopico, sono importanti per valutare nuove terapie. Le conclusioni tratte da qualsiasi set-up sperimentale sono dependent sulle limitazioni del modello.
Numerose tecniche sono state sviluppate per la produzione di tumori della vescica ortotopico nei topi. Questi si affidano danneggiare lo strato glicosaminoglicano della vescica, consentendo cellule tumorali da impiantare. Le tecniche utilizzate comprendono elettrocauterizzazione, che si traduce in un unico punto di danno nella parete della vescica, con conseguente sviluppo del tumore in un sito nella vescica 1,2. Tuttavia, il tasso di successo di impianto tumore, utilizzando elettrocauterizzazione è operatore-dipendente variabili da 10 – 90%, e comprende il pericolo che la parete della vescica viene perforato, portando a sviluppare tumori nella cavità peritoneale. Cauterizzazione chimica viene eseguita utilizzando nitrato d'argento, che danneggia la parete della vescica 3. Analogamente, l'acido è stato usato per danneggiare la parete della vescica 4. Tripsina è stato utilizzato anche per danneggiare la vescica e 5. Questi metodi possono provocare lo sviluppo di più di un tumore nella vescica.Inoltre, vi è il rischio di gravi danni alla vescica se le sostanze chimiche vengono lasciati a contatto con la parete della vescica per troppo tempo. Il metodo sviluppato da Ninalga et al. utilizza il poli-L-lisina carica positiva (PLL) 6 molecole per rivestire la parete della vescica; Questo permette alle cellule tumorali carica negativa ad attaccarsi al livello glicosaminoglicano della vescica. Questo metodo comporta generalmente più di un tumore sviluppare nella vescica, ma tumorale impianto è a 80 – 100% 4,7. Tecnicamente, è anche la procedura più semplice da eseguire. Per garantire che i tumori che si sviluppano sono abbastanza anche in dimensioni, è importante che le cellule tumorali non vengono raggruppati in grandi ciuffi prima dell'impianto.
Per valutare l'efficacia terapeutica, è meglio effettuare questo studio su topi con tumori abbastanza di dimensioni simili. Così, un buon sistema di rilevamento che possono quantificare le dimensioni del tumore subito dopo l'impianto è importante. Diverse strategie sono apen usato per valutare i tumori. Questi includono la risonanza magnetica (MRI) 8-10, fluorescenza 11, bioluminescenza 12,13, ultrasuoni 14, e il dosaggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) 15,16. Mentre MRI e ultrasuoni non richiedono modifiche delle cellule tumorali, vi è la necessità di attrezzature e contrasto sensibili agenti per MRI. I saggi fluorescence-, luminescence-, e basati su ELISA richiedono modifiche delle cellule tumorali per esprimere proteine marker che possono essere rilevati da questi metodi. Per luminescenza, un substrato è necessaria per la rilevazione dell'attività di luciferasi; vi è quindi un passo aggiunto e aumento dei costi. Sia luminescenza e fluorescenza richiedono attrezzature specializzate. Per produrre fluorescenza, proteina fluorescente verde (GFP) ciclizzazione, che viene catalizzata da ossigeno molecolare, è necessaria. Così, l'espressione della GFP può essere variabile all'interno di una massa tumorale seconda accesso ad ossigeno, rendendo questo un indicatore piuttosto affidabile <sup> 17. La modifica della linea di cellule murine cancro alla vescica MB49 a secernere prostatico umano Specific Antigen (PSA) 15,16 come marker surrogato è un'altra strategia. Questi marcatori forniscono anche un mezzo alternativo di conferma presenza del tumore al termine dell'esperimento, rendendoli alternativa alla immunoistochimica. Questo studio riporta il metodo PLL di impianto del tumore ortotopico e presenta un confronto tra sistemi di rilevamento del tumore, cioè ELISA, la fluorescenza, e imaging ad ultrasuoni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi più critiche nel protocollo sono 1) mantenere correttamente la tumorigenicità della linea cellulare; 2) garantire la secrezione di PSA misurabile prima dell'impianto delle cellule tumorali nei topi; 3) generare una cella singola sospensione per l'impianto in modo da ridurre la variazione della dimensione del tumore; e 4) instillare cellule a bassa velocità per evitare vescico-ureterale reflusso, con conseguente impianto di cellule tumorali nel rene.
Dopo passaggio prolunga…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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