Um modelo de tumor de murino de bexiga ortotópico e Tumor Detection System
Summary
Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga ortotópico de murídeo em Ratinhos C57BL / 6J e a monitorização do crescimento do tumor.
Abstract
Este protocolo descreve a geração de tumores da bexiga em ratos C57BL / 6J ratinhos fêmea, utilizando a linha celular de cancro da bexiga de murino MB49, que foi modificado para secretar humano Antigénio Específico da Próstata (PSA), e o procedimento para a confirmação da implantação do tumor. Em resumo, os ratos são anestesiados usando drogas injectáveis e são feitos para colocar na posição dorsal. A urina é desocupado da bexiga e 50 ul de poli-L-lisina (PLL) é instilada lentamente a uma taxa de 10 mL / 20 s utilizando um cateter de 24 g IV. É deixado na bexiga durante 20 minutos por tapando o cateter. O cateter é retirado e PLL é desocupado por uma leve pressão sobre a bexiga. Isto é seguido por instilação da linha celular de cancro da bexiga de murino (1 x 10 5 células / 50 ul) a uma taxa de 10 mL / 20 s. O cateter é tapado para evitar a evacuação prematura. Após 1 h, os ratinhos são reavivado com uma droga inversão, e a bexiga está desocupado. A taxa de instilação lenta é importante,uma vez que reduz o refluxo vesico-ureteral, o que pode causar tumores a ocorrer no tracto urinário superior e nos rins. A linha de células deve ser bem re-suspensa para reduzir a aglutinação de células, como esta pode levar à tamanhos irregulares após a implantação do tumor.
Esta técnica induz tumores com alta eficiência. O crescimento do tumor é monitorizado pela secreção urinária PSA. monitorização PSA marcador é mais fiável do que o ultra-som ou de imagem de fluorescência para a detecção da presença de tumores na bexiga. Os tumores em ratinhos geralmente atingem um tamanho máximo que afeta negativamente a saúde em cerca de 3-4 semanas, se deixados sem tratamento. Ao monitorizar o crescimento do tumor, é possível diferenciar os ratinhos que estavam curados do que aqueles que não foram implantadas com sucesso com tumores. Com a análise de ponto final, apenas, o último pode ser assumida por engano ter sido curado por terapia.
Introduction
O objetivo deste método é gerar tumores de bexiga murino ortotópico e monitorar os tumores implantados mais exacta possível, de modo que os ratos sem a implantação do tumor não são pensados para ter sido curado a análise de ponto final. Em geral, o método mostrado irá reduzir a necessidade de grandes números de ratinhos para análise experimental e assegurar uma maior precisão na determinação dos resultados terapêuticos.
O desenvolvimento de um modelo ortotópico de câncer é importante, como células tumorais implantando subcutânea não recapitular o ambiente da doença clínica ou permitir o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A arquitectura da bexiga permite a instilação de terapias do cancro da bexiga directamente na bexiga com efeitos sistémicos mínimos. Assim, os modelos animais que recapitulam neste ambiente, tais como um modelo ortotópico, são importantes para avaliar novas terapias. As conclusões tiradas a partir de qualquer experimental set-up são dependenT sobre as limitações do modelo.
Diversas técnicas têm sido desenvolvidas para a produção de tumores da bexiga ortotópico em murganhos. Estes dependem danificar a camada de glicosaminoglicano da bexiga, permitindo que as células tumorais a ser implantado. As técnicas utilizadas incluem a electrocauterização, o que resulta em um único ponto de dano na parede da bexiga, conduzindo ao desenvolvimento de tumores em um local na bexiga 1,2. No entanto, a taxa de sucesso da implantação do tumor usando electrocauterização é dependente do operador variando de 10 – 90%, e inclui o risco de que a parede da bexiga será perfurado, levando a desenvolver tumores na cavidade peritoneal. Cauterização química é realizada utilizando nitrato de prata, que danifica a parede da bexiga 3. Da mesma forma, o ácido foi utilizado para danificar a parede da bexiga 4. A tripsina também tem sido utilizado para danificar a bexiga, bem 5. Estes métodos podem resultar no desenvolvimento de mais de um tumor na bexiga.Além disso, existe o perigo de danos graves para a bexiga se os produtos químicos são deixados em contacto com a parede da bexiga por muito tempo. O método desenvolvido por Ninalga et ai. utiliza o poli-L-lisina carregada positivamente (PLL) 6 moléculas para o revestimento da parede da bexiga; isso permite que as células tumorais carregadas negativamente para furar a camada de glicosaminoglicanos da bexiga. Este método resulta geralmente em mais do que um tumor em desenvolvimento na bexiga, mas a implantação do tumor é a 80 – 100% 4,7. Tecnicamente, é também o processo mais fácil de executar. Para assegurar que os tumores que se desenvolvem são bastante uniforme em tamanho, é importante que as células tumorais não são agrupados em grandes aglomerados antes do implante.
A fim de avaliar a eficácia terapêutica, é melhor para realizar este estudo em ratos com tumores bastante de tamanho semelhante. Assim, um sistema de detecção de boa que pode quantificar o tamanho do tumor logo após o implante é importante. Várias estratégias têm a abelhaN utilizado para avaliar tumores. Estes incluem a imagiologia por ressonância magnética (MRI) de 8-10, de fluorescência 11, bioluminescência 12,13, ultra-sons 14, e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) 15,16. Enquanto ressonância magnética e ultra-som não requerem modificações de células tumorais, existe uma necessidade de equipamentos e agentes de contraste para ressonância magnética sensíveis. Os ensaios fluorescence-, luminescence-, e baseado em ELISA exigir a modificação das células tumorais para expressar proteínas marcadoras que podem ser detectados por estes métodos. Para luminescência, um substrato é necessária para a detecção da actividade de luciferase; Assim, existe um passo adicional e aumento de custo. Ambos luminescência e fluorescência requerem equipamento especializado. Para produzir fluorescência, proteína fluorescente verde (GFP) ciclização, a qual é catalisada por oxigénio molecular, é necessária. Assim, a expressão GFP pode ser variável dentro de uma massa tumoral dependendo do acesso ao oxigênio, tornando este um marcador pouco fiável <sup> 17. Modificação da linha de células de cancro da bexiga murino MB49 a secretar próstata humana Specific Antigen (PSA) 15,16 como um marcador substituto é outra estratégia. Esses marcadores também fornecem um meio alternativo de confirmar a presença do tumor no final da experiência, tornando-os uma alternativa à imuno-histoquímica. Este estudo relata o método PLL de implantação do tumor ortotópico e apresenta uma comparação de sistemas de detecção de tumor, isto é, ELISA, a fluorescência, e ultra-sonografia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os passos mais críticos no protocolo são: 1) manter com sucesso a tumorigenicidade da linha celular; 2) assegurando a secreção PSA mensurável antes da implantação de células tumorais em camundongos; 3) a geração de uma suspensão de uma única célula para o implante, de modo a reduzir a variação no tamanho do tumor; e 4) células instilar a uma velocidade lenta para evitar o refluxo vesico-ureteral, resultando na implantação de células de tumor no rim.
Após passagem prolonga…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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