Un Modelo de tumor y el tumor murino ortotópico de vejiga Sistema de Detección
Summary
Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga ortotópico murino en ratones C57BL / 6J hembra y el seguimiento del crecimiento del tumor.
Abstract
Este protocolo describe la generación de tumores de vejiga en ratones C57BL / 6J hembra utilizando la línea celular de cáncer de vejiga murino MB49, que ha sido modificado para secretar de próstata humano de antígeno específico (PSA), y el procedimiento para la confirmación de la implantación del tumor. En resumen, los ratones se anestesiaron usando drogas inyectables y están hechos para poner en la posición dorsal. La orina está desocupado desde la vejiga y 50 l de poli-L-lisina (PLL) se instila lentamente a una velocidad de 10 l / s 20 utilizando un catéter 24 G IV. Se deja en la vejiga durante 20 min por tapando el catéter. Se retira el catéter y el PLL está desocupado por una suave presión sobre la vejiga. Esto es seguido por la instilación de la línea celular de cáncer de vejiga murino (1 x 10 5 células / 50 l) a una velocidad de 10 l / 20 s. El catéter se tapó para evitar la evacuación prematura. Después de 1 h, los ratones se revivieron con un fármaco de reversión, y la vejiga esté desocupado. La tasa de instilación lenta es importante,ya que reduce el reflujo vesico-ureteral, lo que puede hacer que los tumores se producen en el tracto urinario superior y en los riñones. La línea celular debe estar bien volvió a suspenderse para reducir la aglutinación de las células, ya que esto puede conducir a tamaños irregulares después de la implantación del tumor.
Esta técnica induce tumores con alta eficiencia. El crecimiento tumoral se controló mediante la secreción de PSA urinaria. monitoreo marcador PSA es más fiable que el ultrasonido o imágenes de fluorescencia para la detección de la presencia de tumores en la vejiga. Los tumores en los ratones generalmente alcanzan un tamaño máximo que repercute negativamente en la salud por cerca de 3 – 4 semanas si no se tratan. Mediante el control de crecimiento del tumor, es posible diferenciar los ratones que fueron curados de las que no fueron implantados con éxito con los tumores. Con el análisis de punto final únicamente, el último puede ser erróneamente supone que se han curado mediante terapia.
Introduction
El objetivo de este método es generar tumores de vejiga murino ortotópico y para controlar los tumores implantados con la mayor precisión posible, de manera que los ratones sin la implantación del tumor no se cree que se han curado a análisis de punto final. En general, el método que se muestra reducirá la necesidad de un gran número de ratones para el análisis experimental y garantizar una mayor precisión en la determinación de los resultados terapéuticos.
El desarrollo de un modelo ortotópico de cáncer es importante, ya que la implantación de las células tumorales por vía subcutánea no recapitula el medio ambiente de la enfermedad clínica o permiten el desarrollo de estrategias terapéuticas. La arquitectura de la vejiga permite la instilación de las terapias de cáncer de vejiga directamente en la vejiga con efectos sistémicos mínimos. Por lo tanto, los modelos animales que recapitular este entorno, tales como un modelo ortotópico, son importantes para evaluar nuevas terapias. Las conclusiones extraídas de cualquier montaje experimental se dependent sobre las limitaciones del modelo.
Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de los tumores de vejiga ortotópico en ratones. Estos dependen de dañar la capa de glicosaminoglicano de la vejiga, lo que permite las células tumorales para ser implantado. Las técnicas utilizadas incluyen la electrocauterización, que resulta en un único punto de daño en la pared de la vejiga, lo que lleva al desarrollo de tumores en un sitio en la vejiga 1,2. Sin embargo, la tasa de éxito de la implantación del tumor usando electrocauterización es dependiente del operador que varía de 10 – 90%, y que incluye el peligro de que la pared de la vejiga se punza, lo que lleva a los tumores en desarrollo en la cavidad peritoneal. Cauterización química se lleva a cabo utilizando nitrato de plata, lo que daña la pared de la vejiga 3. Del mismo modo, el ácido se ha utilizado para dañar la pared de la vejiga 4. La tripsina también se ha utilizado para dañar la vejiga, así 5. Estos métodos pueden resultar en el desarrollo de más de un tumor en la vejiga.Además, existe el peligro de un daño severo a la vejiga si los productos químicos se dejan en contacto con la pared de la vejiga durante demasiado tiempo. El método desarrollado por Ninalga et al. utiliza el poli-L-lisina cargada positivamente (PLL) 6 moléculas para recubrir la pared de la vejiga; esto permite que las células tumorales con carga negativa a pegarse a la capa de glicosaminoglicano de la vejiga. Este método da como resultado en general en más de un tumor en desarrollo en la vejiga, pero la implantación del tumor es a 80 – 100% de 4,7. Técnicamente, también es el procedimiento más fácil de realizar. Para asegurarse de que los tumores que se desarrollan son bastante uniforme en tamaño, es importante que las células tumorales no se agrupan en grupos grandes antes de la implantación.
Con el fin de evaluar la eficacia terapéutica, lo mejor es llevar a cabo este estudio en ratones con tumores bastante de tamaño similar. Por lo tanto, un buen sistema de detección que puede cuantificar el tamaño del tumor pronto después de la implantación es importante. Varias estrategias han de abejasn utiliza para evaluar tumores. Estos incluyen imágenes por resonancia magnética (IRM) 8-10, 11 de fluorescencia, bioluminiscencia 12,13, ultrasonido 14, y el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) 15,16. Mientras que la RM y la ecografía no requieren modificaciones de las células tumorales, hay una necesidad de equipos y agentes de contraste para resonancia magnética sensibles. Los ensayos por fluorescencia, luminiscencia, y basados en ELISA requieren modificación de las células tumorales para expresar proteínas marcadoras que se pueden detectar por estos métodos. Por luminiscencia, se requiere un sustrato para la detección de la actividad de la luciferasa; Por lo tanto, hay un paso adicional y aumento del coste. Tanto la luminiscencia y fluorescencia requieren equipo especializado. Para producir fluorescencia, proteína fluorescente verde (GFP) de ciclación, que es catalizada por el oxígeno molecular, se requiere. Por lo tanto, la expresión de GFP puede ser variable dentro de una masa tumoral en función de acceso al oxígeno, haciendo de este un marcador más fiable <sup> 17. La modificación de la línea celular de cáncer de vejiga murino MB49 para secretar próstata humana Antígeno Específico (PSA) 15,16 como un marcador sustituto es otra estrategia. Estos marcadores también proporcionan un medio alternativo para confirmar la presencia del tumor en la terminación del experimento, por lo que una alternativa a la inmunohistoquímica. Este estudio reporta el método PLL de la implantación del tumor ortotópico y presenta una comparación de los sistemas de detección de tumores, a saber, ELISA, fluorescencia, y las imágenes por ultrasonido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más críticos en el protocolo son 1) el mantenimiento con éxito la tumorigenicidad de la línea celular; 2) asegurar la secreción de PSA medible antes de la implantación de células tumorales en ratones; 3) la generación de una suspensión de una sola célula para la implantación con el fin de reducir la variación en el tamaño del tumor; y 4) infundir células a una velocidad lenta para prevenir el reflujo vesico-ureteral, lo que resulta en la implantación de células tumorales en el riñón.
<p c…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
Materials
| MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
| RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
| L-glutamine | Biowest | X0550 | |
| Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
| Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
| free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
| TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
| TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
| C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
| Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
| Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
| Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
| Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
| Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
| Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
| Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
| Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
| Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
| Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
| Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
| RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Equipment and Software | |||
| 7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
| 7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
| Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
| BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
| IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
| Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
| Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |
References
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