Génération d'Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Résumé

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la génération efficace d’iPSC sans intégration à partir de cellules sanguines périphériques humaines adultes. Grâce à l’utilisation de quatre vecteurs épisomaux basés sur oriP/EBNA pour exprimer les facteurs de reprogrammation, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 et SOX2, des milliers de colonies d’iPSC peuvent être obtenues à partir de 1 mL de sang périphérique.

Résumé

Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont très prometteurs pour la modélisation des maladies et des thérapies régénératrices. Nous avons précédemment rapporté l'utilisation de vecteurs épisomiques (EV) pour générer CSPi sans intégration-à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique (PB MNC). Les vecteurs épisomiques utilisés sont des plasmides d'ADN incorporés avec oriP et EBNA1 éléments provenant du virus d' Epstein-Barr (EB), qui permettent la réplication et à long terme retainment de plasmides dans des cellules de mammifères, respectivement. Avec une optimisation plus poussée, des milliers de colonies iPSC peuvent être obtenus à partir de 1 ml de sang périphérique. Deux facteurs essentiels pour atteindre l'efficacité élevée de reprogrammation sont: 1) l'utilisation d'un 2A "auto-clivage" peptide pour relier OCT4 et SOX2, réalisant ainsi l'expression équimolaire des deux facteurs; 2) l'utilisation de deux vecteurs pour exprimer MYC et KLF4 individuellement. Nous décrivons ici un protocole étape par étape pour générer iP sans intégration,SCs à partir d'échantillons périphériques adultes de sang. Les CSPi générées sont libres d'intégration, comme des plasmides épisomiques résiduels sont indétectables après cinq passages. Bien que l'efficacité de reprogrammation est comparable à celle du virus Sendai (SV) des vecteurs, des plasmides EV sont beaucoup plus économiques que les vecteurs SV disponibles dans le commerce. Ce système EV de reprogrammation abordable détient un potentiel pour des applications cliniques en médecine régénératrice et fournit une approche pour la reprogrammation directe des multinationales PB aux cellules sans intégration-mésenchymateuses souches, les cellules souches neurales, etc.

Introduction

Après l'expression forcée de plusieurs facteurs de transcription (C. -à- OCT4, SOX2, MYC et KLF4), les cellules somatiques peuvent être reprogrammées pour induits des cellules souches pluripotentes (CISP), qui sont très prometteurs pour des applications en médecine régénérative et la thérapie cellulaire de remplacement ^1-3. À ce jour, diverses méthodes ont été développées pour augmenter le taux de reprogrammation ^4-7 de succès. vecteurs induite par la reprogrammation virale est largement utilisé pour la production efficace de CSPi, parce que l'intégration virale conduit à un niveau élevé, l'expression stable des f....

Protocole

Tous les échantillons PB humains ont été obtenus à partir de donneurs adultes anonymes avec aucune information d'identification disponibles à partir de Tianjin Blood Center avec l'approbation du comité d'éthique de la recherche locale.

Plasmide Préparation 1. Endo-free

1. Utiliser un kit de purification de plasmide commercial Maxi pour extraire des vecteurs épisomiques de E. coli conformément au protocole du fabricant. Pour l'étape finale, tampon TE substitut à l'eau stérile sans endotoxine pour dissoudre le culot d'ADN.
2. Mesurer la concentration d'ADN en utilisant un spectrophotomètre....

Résultats

En utilisant ce protocole, nous pouvons obtenir des centaines de colonies de 1 x 10 ⁵ nucleofected PB MNC (Figures 1A et 1B). L'efficacité de reprogrammation est d' environ 0,2 à 0,5% et les colonies expriment des marqueurs de pluripotence (figures 1C et 1D). CSPi générées en utilisant le protocole décrit sont libres d' intégration et ont la capacité de former tératome composant les 3 couches germi.......

Discussion

L'acquisition d'échantillons de sang provenant de donneurs sains ou de patients est pratique et non invasive, ce qui en fait une source de cellules attrayante pour la recherche fondamentale et la thérapie cellulaire clinique. Ici, nous avons décrit un protocole pour la production hautement efficace de iPSCs libre rapprochement à partir d'échantillons de sang périphérique. Cette approche reproductible et abordable devrait bénéficier le domaine iPSC.

Nous avons signalé qu'il ya.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Expansion de cellules souches hématopoïétiques medium	Sigma	S0192	Stocker à 4 ° ; C
Facteur de cellules souches humaines (SCF)	Peprotech	300-07	Se conserve à -20 ou -80 ° ; C
Interleukine-3 (IL-3)	Peprotech	AF-200-03	Se conserve à -20 ou -80 ° ; C
Érythropoïétine (EPO)	Peprotech	100-64	Se conserve à -20 ou -80 ° ; C
Facteur de croissance de l’insuline-1 (IGF-1)	Peprotech	100-11	Se conserve à -20 ou -80 ° ; C
Dexaméthasone	Sigma	D4902	Se conserver à -20 ou -80 ° ; C
1-thioglycérol (MTG)	Sigma	M6145	Conserver à -20 ou -80 ° ; C
DMEM/F12 medium	Gibco	112660-012	Stocker à 4 ° ; C
L-glutamine (100x)	Gibco	25030-081	Stocker à -20 ° ; C
Pénicilline/Streptomycine (100x)	Gibco	15140-122	Conserver à -20 ° ; C
Solution d’acides aminés non essentiels (100x)	Gibco	11140-050	Conserver à 4 ° ; C
Facteur de croissance des fibroblastes 2 (FGF2)	Peprotech	100-18B	Se conserve à -20 ou -80 ° ; C
Insuline-Transferrine-Sélénium (ITS, 100x)	Gibco	41400-045	Stocker à 4 ° ; C
Acide ascorbique	Sigma	49752	Stocker à -20 ° ; C
DMEM (high glucose) moyen	Thermo	SH30243.01B	Stocker à 4 ° ; C
Sérum fœtal bovin (FBS)	Hyclone	SV30087.01	Se conserve à -20 ° ; C
Ficoll	GE Healthcare, SIGMA	17-5442-02	Magasin chez RT
Trehalose	Sigma	T9531	Magasin au 4 ° ; C
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma	D2650	Stocker chez RT, protéger de la lumière
Endofree Plasmid Maxi Kit (10)	Qiagen	12362	Stocker chez RT
IMDM	Gibco	21056-023	Stocker à 4 ° ; C
Human CD34+ Cell Nucleofection Kit	Lonza	VPA-1003	Stocker à RT, le tampon de nucléofection et le supplément doivent être stockés à 4 ° ; C
Butyrate de sodium	Sigma	B5887	Conserver à -20 ou -80 ° ; C
ROCK inhibiteur - Y27632	STEMGENT	04-0012-10	Stocker à -20 ° ; C
Essential 8 milieu basal (E8)	Gibco	A15169-01	Stocker à 4 ° ; C, le supplément doit être conservé à -20 ou -80 ° ; C
Matrigel	BD	354277	Se stocker à -20 ou -80 °C C
2x EasyTaq PCR SuperMix (+colorant)	TransGen Biotech	AS111	Stocker à -20 ° ; C
Solution de décollement de cellules	STEMGENT	01-0006	Conserver à -20 ° ; C, Accutase comme solution de détachement cellulaire pour obtenir une suspension monocellulaire
DAPI	Sigma	D9542-1MG	Stocker à 4 ou -20 ° ; C
Anti-Nanog AF488	BD	560791	Boutique à 4 ° ; C, anticorps primaire utilisé pour l’immunofluorescence, diluer 1/100 lorsqu’il est utilisé
Anti-OCT4	abcam	ab19857	Conserver à 4 ° ; C, anticorps primaire utilisé pour l’immunofluorescence, diluer 1/100 lorsqu’il est utilisé
AF488 âne anti-souris IgG	Invitrogen	A21202	Stocker à 4 ° ; C, anticorps secondaire utilisé pour l’immunofluorescence,  ; diluer 1/500 en cas d’utilisation
PE anticorps TRA-1-60-R humain	Biolegend	330610	Conserver à 4 ° ; C, anticorps utilisé pour la cytométrie en flux
eFluor 570-conjugué anti-SSEA4	eBioscience	41-8843	Stocker à 4 ° ; C, anticorps utilisé pour la cytométrie en flux
Anticorps isotype	eBioscience	11-4011	Stocker à 4 ° ; C, anticorps utilisé pour la cytométrie en flux
Kit de détection de la phosphatase alcaline	SiDanSai	1102-100	Stocker à 4 ° ; C
Kit d’extraction d’ADN génomique	TIANGEN	DP304-02	Magasin chez RT
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	Magasin chez RT
Analyseur de cellules par cytométrie en flux	BD	LSRII
Spinning Disk Microscope confocal (SDC)	PerkinElmer	UltraVIEW VOX	pour l’imagerie confocale
Dispositif de nucléofection	Lonza	Nucleofector 2b	pour la nucléofection de PB MNC
ImageQuant LAS-4010	GE		pour prendre des photos de coloration AP en vrac