Tunable Hydrogele aus Pulmonary Extrazellulärmatrix für 3D-Zellkultur
Summary
Dies ist eine Methode, um eine 3-dimensionale Zellkultur Gerüst von pulmonaler extrazellulären Matrix zu schaffen. Intact Lunge in Hydrogelen verarbeitet, die das Wachstum von Zellen in drei Dimensionen zu unterstützen.
Abstract
Hier stellen wir ein Verfahren zur Mehrkomponenten – Zellkultur – Hydrogele für de – vitro – Lungen – Zellkultur zu etablieren. Beginnend mit gesunden en bloc Lungengewebe von Schweinen, Ratte oder Maus wird das Gewebe durchblutet und unter Wasser in nachfolgenden chemischen Reinigungsmittel , die Zelltrümmer zu entfernen. Histologische Vergleich des Gewebes vor und nach der Verarbeitung bestätigt Entfernung von mehr als 95% der Doppelstrang-DNA und alpha-Galactosidase-Färbung schlägt die Mehrheit der Zelltrümmer entfernt wird. Nach Dezellularisierung wird das Gewebe lyophilisiert und dann in ein Pulver cryomilled. Das Matrixpulver wird 48 h in einer sauren Pepsinverdau Lösung verdaut und dann die Pregel-Lösung neutralisiert zu bilden. Gelieren der Pregel Lösung kann durch Inkubation bei 37 ° C induziert werden und kann unmittelbar nach der Neutralisation oder bei 4 ° C gelagert werden für bis zu zwei Wochen. Beschichtungen können unter Verwendung der Vorgellösung auf einer nicht behandelten Platte für c gebildet werdenell Befestigung. Zellen können in dem Vorgel vor Selbstmontage ausgesetzt werden, um eine 3D-Kultur zu erreichen, die auf der Oberfläche eines geformten Gels plattiert, aus dem die Zellen durch das Stützgerüst migrieren können oder auf den Beschichtungen überzogen. Änderungen der Strategie vorgestellt kann Gelierungstemperatur, Stärke oder Protein Fragmentgrößen auswirken. Jenseits Hydrogelbildung kann das Hydrogel Steifigkeit erhöht werden Genipin verwenden.
Introduction
Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.
Protocol
Representative Results
Discussion
Einer der integralen Aspekte der Biologie ist die Selbstorganisation der Moleküle in hierarchischer Strukturen, die eine bestimmte Aufgabe auszuführen. 13 Im Labor Selbstorganisation hängt von zahlreichen Faktoren wie Salzkonzentration, pH, und die Verdauung Dauer. Wie gezeigt ist, selbstorganisierend Hydrogel bildet sich, wenn solubilisiert Proteine Rückkehr zu einer physiologischen Temperatur. Das Hydrogel gebildet ist in der Lage zur Förderung der Zellanhaftung und Proliferation in vitro.</e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten, dass Smithfield Farmen zu danken für die intakte Schweinelungengewebe zu spenden. Wir möchten auch Dr. Hu Yang, Dr. Christina Tang und die VCU Abteilung für Plastische Chirurgie für die Erlaubnis, zu nutzen, um ihre Ausrüstung zu danken. Hydrogele und Gewebeproben wurden für SEM bei der VCU Abteilung für Anatomie vorbereitet und Neurobiologie Mikroskopie Einrichtung unterstützt, teilweise durch die Finanzierung von NIH-NINDS-Center Core-Grants 5 P30 NS047463 und zum Teil durch Finanzierungsform NIH-NCI Cancer Center Support Grants P30 CA016059. REM-Aufnahmen von Proben, die bei der VCU Nanotechnologie Kern Charakterisierung Facility (NCC). Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation, CMMI 1351162 finanziert.
Materials
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use with eye protection and gloves. |
| Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
| DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
| HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
| Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
| PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
| PBS | VWR | 45000-448 | None |
| Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
| Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
| Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
| Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
| Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
| Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |
References
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