Accordable hydrogels de matrice extracellulaire pulmonaire pour la 3D Culture Cellulaire

Résumé

Ceci est une méthode pour créer un échafaudage trois dimensions de culture de cellules de la matrice extracellulaire pulmonaire. poumon Intact est transformé en hydrogels qui peuvent soutenir la croissance des cellules en trois dimensions.

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour établir des composants multiples hydrogels de culture cellulaire pour la culture in vitro de cellules de poumon. En commençant par la santé en tissu bloc pulmonaire de porc, rat ou la souris, le tissu est perfusé et immergé dans les détergents chimiques ultérieures pour éliminer les débris cellulaires. comparaison histologique du tissu avant et après le traitement confirme l'élimination de plus de 95% de la coloration de l'ADN double brin et l'alpha-galactosidase suggère que la majorité des débris cellulaires sont éliminés. Après décellularisation, le tissu est lyophilisé, puis cryomilled en poudre. La poudre de matrice est digéré pendant 48 heures dans une solution de digestion de la pepsine acide, puis on neutralise pour former la solution de pré-gel. Gélification de la solution de pré-gel peut être induite par une incubation à 37 ° C et peut être utilisée immédiatement après la neutralisation ou stocké à 4 ° C pendant jusqu'à deux semaines. Les revêtements peuvent être formés en utilisant la solution de pré-gel sur une plaque non-traitée pour cattachement ell. Les cellules peuvent être mises en suspension dans le pré-gel avant de l'autoassemblage de réaliser une culture en 3D, plaquée sur la surface d'un gel formé à partir de laquelle les cellules peuvent migrer à travers l'échafaudage, ou plaquée sur les revêtements. Les modifications de la stratégie présentés peuvent avoir un impact température de gélification, la force ou la taille des fragments de protéines. Au-delà de la formation d'hydrogel, la rigidité d'hydrogel peut être augmentée en utilisant genipin.

Introduction

La traduction des résultats in vitro en clinique est l’un des problèmes les plus difficiles auxquels sont confrontés les chercheurs biomédicaux. La recherche in vitro sur le plastique de culture tissulaire est plus facile, plus pratique et maintient une viabilité cellulaire élevée. ¹ Cette approche est un point de départ raisonnable, mais les résultats ont une traduction clinique limitée. De plus en plus, les laboratoires intègrent des constructions tridimensionnelles pour remplacer les méthodes bidimensionnelles traditionnelles. Des revues sont disponibles pour de nombreux environnements tridimensionnels, des échafaudages biologiques aux ....

Protocole

Solution	Filtre stérile	instructions
Dih 2 O	Oui	Dih 2 O; filtré de manière stérile
Solution à 0,1% de Triton X-100	Oui	Sous la hotte ajouter 100 pi de Triton-X 100 Solution 100 ml Dih 2 O et agiter jusqu'à dissolution; filtre stérile.
2% de désoxycholate Solution	Oui	Sous la hotte ajouter la solution de désoxycholate de sodium 2 g par 100 ml Dih 2....

Résultats

En utilisant cette méthode, nous avons produit des hydrogels de porc normale, rat, et les poumons de souris (Figure 1). poumons transformés fournissent environ 5 mg, 40 mg et 10 g de poudre ECM respectivement. Un aperçu du procédé est représenté sur la figure 2. visualisations clé au cours du processus comprennent: aspect blanc des poumons après le rinçage désoxycholate; après la formation de pré-gel, une solution doit être opaque et la solution doit app.......

Discussion

Un des aspects les intégrales de la biologie est l'auto-organisation des molécules dans les structures hiérarchiques qui effectuent une tâche spécifique. ¹³ En laboratoire, l' auto-assemblage dépend de nombreux facteurs tels que la concentration en sel, le pH et la durée de digestion. Comme le montre, il se forme d'hydrogel auto-organisation lorsque les protéines solubilisées retour à une température physiologique. L'hydrogel formé est capable de favoriser l' attachement et la prolifératio.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Triton X-100  ;	Fisher Scientific	BP151-100	À utiliser dans la hotte avec des lunettes de protection et des gants.
Désoxycholate de sodium	Sigma-Aldrich	D6750-100g	À utiliser en cagoule avec protection oculaire et gants.
Sulfate	de magnésium Sigma-Aldrich	M7506-500g	Aucun
Chlorure	de calcium Sigma-Aldrich	C1016-500g	Aucun
DNase	Sigma-Aldrich	D5025-150KU	Aucun
HCl	Sigma-Aldrich	258148-500ML	À utiliser avec des lunettes de protection et des gants.
Pepsin	Sigma-Aldrich	P6887-5G	À utiliser dans une hotte avec des lunettes de protection et des gants.
Hydroxyde de sodium	Fisher Scientific	BP359-500	À utiliser avec des lunettes de protection et des gants.
Genipin	Wako Chemicals	078-03021	Utilisation dans la hotte avec protection oculaire et gants.
PBS 10x	Qualité Biologique	119-069-151	Aucun
PBS	VWR	45000-448	Aucun
Papier filtre	Whatman	8519	N/A
Pompe à main	Fisher Scientific	10-239-1	N/A
Bécher	diplômé VitLab	445941	N/A
Cryomill	SPEX	6700	Utiliser des cryogants et un œil protection.
Lyophilizer	FTS FlexiDry		Utilisez des gants.
Rhéomètre	Discovery	HR-2	Utilisez des gants et des lunettes de protection.