यह फेफड़े के बाह्य मैट्रिक्स से एक 3-आयामी सेल संस्कृति पाड़ बनाने के लिए एक विधि है। बरकरार फेफड़ों हाइड्रोजेल कि तीन आयामों में कोशिकाओं के विकास का समर्थन कर सकते में कार्रवाई की है।
यहाँ हम इन विट्रो फेफड़ों सेल संस्कृति के लिए कई घटक सेल संस्कृति हाइड्रोजेल की स्थापना के लिए एक तरीका मौजूद है। एन सुअर, चूहे, या माउस से गुट फेफड़े के ऊतकों को स्वस्थ के साथ शुरू, ऊतक भरकर रखा और बाद में रासायनिक डिटर्जेंट में डूबे हुए सेलुलर मलबे को हटाने के लिए किया जाता है। पहले और प्रसंस्करण के बाद ऊतक के histological तुलना की पुष्टि डबल असहाय डीएनए और अल्फा galactosidase धुंधला की 95% से अधिक के हटाने का सुझाव सेलुलर मलबे के बहुमत निकाल दिया जाता है। decellularization के बाद, ऊतक lyophilized और फिर एक पाउडर में cryomilled है। मैट्रिक्स पाउडर एक अम्लीय पेप्सिन पाचन समाधान में 48 घंटे के लिए पचा और फिर pregel समाधान के लिए फार्म निष्प्रभावी है। pregel समाधान का जमाना 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है और तुरंत बाद निराकरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है या अप करने के लिए दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। कोटिंग्स सी के लिए एक गैर इलाज प्लेट पर pregel समाधान का उपयोग गठन किया जा सकतापक्ष लगाव। प्रकोष्ठों pregel आत्म विधानसभा के लिए पहले एक 3 डी संस्कृति को प्राप्त करने के लिए, एक का गठन जेल जो कोशिकाओं से पाड़ के माध्यम से विस्थापित कर सकते हैं, या कोटिंग्स पर चढ़ाया की सतह पर चढ़ाया में निलंबित किया जा सकता है। रणनीति के लिए परिवर्तन जमाना तापमान, शक्ति, या प्रोटीन टुकड़ा आकार को प्रभावित कर सकता प्रस्तुत किया। हाइड्रोजेल गठन के अलावा, हाइड्रोजेल कठोरता genipin का उपयोग कर बढ़ाया जा सकता है।
Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.
जीव विज्ञान के अभिन्न पहलुओं में से एक hierarchal संरचनाओं कि एक विशिष्ट कार्य में अणुओं की आत्म संगठन है। 13 प्रयोगशाला में, आत्म विधानसभा में इस तरह के नमक एकाग्रता, पीएच, और पाचन अवधि के रूप में कई कारकों …
The authors have nothing to disclose.
हम बरकरार सुअर फेफड़े के ऊतकों दान के लिए Smithfield खेतों को धन्यवाद देना चाहूंगा। हम यह भी हमें अपने उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए डॉ हू यांग, डॉ क्रिस्टीना तांग और VCU प्लास्टिक सर्जरी विभाग को धन्यवाद देना चाहूंगा। हाइड्रोजेल और ऊतकों के नमूनों, शरीर रचना विज्ञान और तंत्रिका जीव विज्ञान माइक्रोस्कोपी सुविधा के VCU विभाग में SEM के लिए तैयार किए गए समर्थित, भाग में भाग में एनआईएच-NINDS केंद्र कोर अनुदान 5 P30 NS047463 से धन और, द्वारा वित्त पोषण के रूप एनआईएच-NCI कैंसर केंद्र सहायता अनुदान द्वारा P30 CA016059। VCU नैनो कोर विशेषता सुविधा (एनसीसी) पर नमूने के SEM इमेजिंग। यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, सीएमएमआई 1351162 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use with eye protection and gloves. |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
PBS | VWR | 45000-448 | None |
Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |