Detta är en metod för att skapa en 3-dimensionell cellodling scaffold från pulmonell extracellulär matris. Intakt lunga bearbetas till hydrogeler som kan stödja tillväxten av celler i tre dimensioner.
Här presenterar vi en metod för upprättande av multipla komponentcellodlings hydrogeler för in vitro-lungcellkultur. Från och med friska klump lungvävnad från svin, råtta eller mus, är vävnaden perfunderas och nedsänkt i efterföljande kemiska rengöringsmedel för att avlägsna cellrester. Histologisk jämförelse av vävnaden före och efter bearbetning bekräftar avlägsnande av över 95% av dubbelsträngat DNA och alfa galaktosidas-färgning antyder majoriteten av cellrester avlägsnas. Efter decellularisering är vävnaden lyofiliserades och sedan cryomilled till ett pulver. Grundmassepulvret digereras under 48 timmar i en sur pepsindigestion lösning och därefter neutraliseras för att bilda den förgelen lösning. Gelning av förgelen lösning kan induceras genom inkubation vid 37 ° C och kan användas omedelbart efter neutralisation eller lagras vid 4 ° C i upp till två veckor. Beläggningar kan bildas med användning av förgelen lösning på en icke-behandlad platta för cell fastsättning. Celler kan suspenderas i förgelen före självmontering för att uppnå en 3D-kultur, pläterade på ytan av en formad gel från vilken cellerna kan migrera genom ställningen, eller pläterade på beläggningarna. Ändringar den strategi som kan påverka gelningstemperaturen, styrka, eller proteinfragment storlekar. Bortom hydrogel formation, kan hydrogelen styvhet ökas med hjälp av genipin.
Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6.
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research.
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.
En av de integrerade delar av biologin är självorganisering av molekyler i hierarkiska strukturer som utför en specifik uppgift. 13 I labbet, självorganisering beror på flera faktorer, såsom saltkoncentration, pH, och matsmältning varaktighet. Såsom visas är en självorganiserande hydrogel bildas när solubiliserade proteiner återvänder till en fysiologisk temperatur. Hydrogelen som bildas är i stånd att befrämja cellulär infästning och proliferation in vitro.
<p class="jove_conte…The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Smithfield lantgårdar för att donera den intakta svinlungvävnad. Vi vill också tacka Dr Hu Yang, Dr. Christina Tang och VCU plastikkirurgi Institutionen för att tillåta oss att använda sin utrustning. Hydrogel och vävnadsprover bereddes för SEM vid VCU Institutionen för anatomi och neurobiologi Mikroskopi Facility stöds delvis genom finansiering från NIH-NINDS Center Kärna Grant 5 P30 NS047463 och delvis genom finansiering formen NIH-NCI Cancer Center Support Grant P30 CA016059. SEM avbildning av prover vid VCU Nanotechnology Kärna karakterisering Facility (NCC). Detta arbete har finansierats av National Science Foundation, CMMI 1.351.162.
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750-100g | Use with eye protection and gloves. |
Magnesium Sulfate | Sigma-Aldrich | M7506-500g | None |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016-500g | None |
DNase | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | None |
HCl | Sigma-Aldrich | 258148-500ML | Use with eye protection and gloves. |
Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-500 | Use with eye protection and gloves. |
Genipin | Wako Chemicals | 078-03021 | Use in fume hood with eye protection and gloves. |
PBS 10x | Quality Biological | 119-069-151 | None |
PBS | VWR | 45000-448 | None |
Filter Paper | Whatman | 8519 | N/A |
Hand pump | Fisher Scientific | 10-239-1 | N/A |
Graduate Beaker | VitLab | 445941 | N/A |
Cryomill | SPEX | 6700 | Use cryogloves and eye protection. |
Lyophilizer | FTS FlexiDry | Use gloves. | |
Rheometer | Discovery | HR-2 | Use gloves and eye protection. |