تفعيل الالتهام الذاتي من قبل بممارسة الهوائية في الفئران
Summary
تفعيل الالتهام الذاتي هو مفيد في الوقاية من عدد من الأمراض. واحدة من الطرق الفسيولوجية للحث على الالتهام الذاتي في الجسم الحي هو ممارسة الرياضة البدنية. نحن هنا تظهر كيفية تفعيل الالتهام الذاتي عن طريق التمارين الرياضية وقياس مستويات الالتهام الذاتي في الفئران.
Abstract
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
Introduction
الالتهام الذاتي هو مسار تدهور الحفاظ تطويريا، والذي يتسبب في استجابة لمختلف ظروف الإجهاد مثل الجوع ونقص الأكسجة 1 و 2. خلال الالتهام الذاتي، حويصلات المزدوج غشاء، ودعا autophagosomes، دمج المكونات التحت خلوية غير الضرورية أو التالفة ونقلها إلى الجسيمات الحالة لتدهور 3. الالتهام الذاتي القاعدية أمر ضروري من أجل وظيفة الخلوية وتطوير الحي، وضعف الالتهام الذاتي القاعدية هو متورط في العديد من الاضطرابات، بما في ذلك تنكس عصبي، تكون الأورام والسكري من النوع 2 4، 5، 6.
والالتهام الذاتي محفز الفسيولوجية المعروفة هو الجوع. ومع ذلك، فقد اثنين من القيود الرئيسية. أولا، يأخذ الجوع لفترة طويلة للحث على الالتهام الذاتي بشكل فعال في الحيوانات، على سبيل المثال، 48 ساعة من تقييد الغذاء في الفئرانفي معظم الأجهزة. ثانيا، المجاعة بالكاد يدفع الالتهام الذاتي الدماغ، نظرا لتوريد المواد الغذائية مستقرة نسبيا في الدماغ. في الواقع، فإنه من الصعب أيضا للكشف عن الالتهام الذاتي تحريض من قبل محرضات جزيء صغير، والعديد من الأدوية لا يمكن ان تمر حاجز الدم في الدماغ. وبالتالي، لتحليل أفضل وظيفة تفعيل الالتهام الذاتي في التسبب بالمرض، اكتشفنا مؤخرا أن ممارسة هي طريقة الفسيولوجية أكثر قوة للحث على الالتهام الذاتي في فترة قصيرة من الزمن 7، 8، 9. مقارنة مع الجوع، والناجم عن الالتهام الذاتي على نحو فعال عن طريق تشغيل حلقة مفرغة بأسرع 30 دقيقة. وهكذا، وممارسة هو نهج الفسيولوجية مريحة وقوية لدراسة آلية الالتهام الذاتي في التوسط الفوائد الصحية والوقاية من الأمراض.
هناك العديد من علامات البروتين للكشف عن النشاط الالتهام الذاتي، بما في ذلك LC3 وP62. LC3 (المرتبطة أنيبيب البروتين 1A / 1B-الخفيفة جهين 3) هو بروتين عصاري خلوي (LC3-I تشكيل) الذي يضاف إلى PE (فسفاتيديل إيثانولامين) على تحريض الالتهام الذاتي. وجندت LC3 lipidated PE (شكل LC3-II) على الأغشية autophagosomal، ويمكن استخدامها لتصور autophagosomes عندما المسمى مع GFP. النبات في الفترة من العصارة الخلوية إلى منقط هياكل autophagosomes تحت المجهر وهذا مؤشر على تحريض الالتهام الذاتي. P62 هو مستقبلات البضائع لركائز الالتهام الذاتي (مثل البروتينات ubiquitination)، وأدرج في autophagosomes كذلك. منذ تتحلل البروتين في الجسيمات الحالة جنبا إلى جنب مع autophagosomes، مستوياته يمكن استخدامها لقياس تدفق الالتهام الذاتي. نحن هنا تظهر كيفية استخدام هذه العلامات لتحديد الالتهام الذاتي في أنسجة مختلفة الماوس الناجم عن التمارين الرياضية، بما في ذلك ممارسة القسري (مفرغة) وممارسة طوعية (تشغيل العجلات). ويمكن أيضا أن تطبق نفس الإجراءات لفي الجسم الحي قياس الالتهام الذاتي بعد العلاج من محرضات أخرى.
Protocol
Representative Results
Discussion
الالتهام الذاتي هو عملية الهدم التي توفر الطاقة ويقلل من السمية الخلوية بسبب تدهور الليزوزومية من مكونات السيتوبلازم أو العضيات التالفة. دراسة الالتهام الذاتي مهم لفهم تنظيم التوازن الخلوي وآليات الاستجابة للضغط النفسي. النماذج والمنهجيات الجديدة والناشئة في مجا?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Materials
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
