オートファジーの活性化は、多くの疾患の予防に有益です。 生体内でオートファジーを誘導する生理的なアプローチの一つは、物理的な運動です。ここでは、有酸素運動によってオートファジーを活性化し、マウスにおけるオートファジーのレベルを測定する方法を示しています。
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
オートファジーは、飢餓および低酸素1,2のような種々のストレス条件に応答して誘導される進化的に保存された分解経路です。オートファジーの間、オートファゴソームと呼ばれる二重膜小胞は、不要なまたは損傷した細胞内のコンポーネントを組み込み、劣化3のためのリソソームにそれらを運びます。基底オートファジーは、細胞機能および生物の開発のために不可欠であり、障害のある基底オートファジーは神経変性、腫瘍形成および2型糖尿病4、5、6を含む多くの疾患に関与しています。
最もよく知られている生理的オートファジー誘導因子が飢餓です。しかし、それは、2つの主要な制限を有します。まず、飢餓は、 例えば 、効果的動物でオートファジーを誘導するために、マウスにおける食物制限の48時間を長い期間を要しますほとんどの臓器インチ第二に、飢餓はほとんど脳内で比較的安定した栄養供給に起因する脳のオートファジーを誘導します。実際には、多くの薬物は、血液脳関門を通過できないように、小分子誘導物質によってオートファジーの誘導を検出することも困難です。このように、より良い疾患の病因におけるオートファジーの活性化の機能を分析するために、我々は最近、運動は時間7、8、9の短い期間でオートファジーを誘導するために、より強力な生理的な方法であることを発見しました。飢餓と比較して、オートファジーを効果的に30分ほど速く実行トレッドミルによって誘導されます。このように、運動は健康上の利点を仲介し、疾患の予防にオートファジーのメカニズムを研究するための便利で強力な生理的なアプローチです。
LC3およびP62を含むオートファジー活性の検出のためのいくつかのタンパク質マーカーがあります。 LC3(微小管結合タンパク質1A / 1B-光Cヘイン3)は、オートファジーの誘導時にPE(ホスファチジルエタノールアミン)に結合しているサイトゾルタンパク質(LC3-I型)です。 PE脂質化LC3(LC3-II型)は、オートファゴソーム膜に動員され、GFPで標識したときオートファゴソームを可視化するために使用することができます。顕微鏡下でオートファゴソームの構造を点状にする細胞質ゾルからの転座は、オートファジー誘導の指標です。 P62は、(例えば、ユビキチン化タンパク質など)オートファジー基板のカーゴ受容体であり、同様にオートファゴソームに組み込まれます。タンパク質は、オートファゴソームとともにリソソームで分解されるので、そのレベルは、オートファジーフラックスを測定するために使用することができます。ここでは、強制運動(トレッドミル)と自発運動(車輪を実行している)などの有酸素運動によって誘発される異なるマウス組織でオートファジーを定量化するために、これらのマーカーを使用する方法を示しています。同じ手順は、他の誘導物質を処理した後、オートファジーのインビボ測定に適用することができます。
オートファジーは、エネルギーを提供し、細胞質成分または損傷した細胞小器官のリソソーム分解により細胞毒性を減少させる異化プロセスです。オートファジーの研究は細胞の恒常性の調節およびストレス応答のメカニズムを理解することが重要です。新モデルと方法論は、多くの病理学的プロセス16、17にどのように寄与するかを損なわオート?…
The authors have nothing to disclose.
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
ImageJ | NIH |