चूहे में एरोबिक व्यायाम से भोजी को सक्रिय
Summary
भोजी सक्रियण रोगों के एक नंबर की रोकथाम में फायदेमंद है। शारीरिक तरीकों में से एक के लिए प्रेरित करने विवो में भोजी शारीरिक व्यायाम है। यहाँ हम कैसे एरोबिक व्यायाम से भोजी को सक्रिय करने और चूहों में भोजी के स्तर को मापने के लिए दिखा।
Abstract
Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.
Introduction
भोजी एक evolutionarily संरक्षित गिरावट मार्ग, जो इस तरह भुखमरी और हाइपोक्सिया 1, 2 के रूप में विभिन्न तनाव की स्थिति के जवाब में प्रेरित किया जाता है। भोजी के दौरान, डबल झिल्ली पुटिकाओं, autophagosomes कहा जाता है, अनावश्यक या क्षतिग्रस्त subcellular घटकों को शामिल करने और उन्हें गिरावट 3 के लिए लाइसोसोम में परिवहन। बेसल भोजी सेलुलर समारोह और जीव विकास, और बिगड़ा बेसल भोजी के लिए आवश्यक neurodegeneration, tumorigenesis और टाइप 2 मधुमेह 4, 5, 6 सहित कई विकारों में फंसा हुआ है।
सबसे प्रसिद्ध मनोवैज्ञानिक भोजी inducer भुखमरी है। हालांकि, यह दो प्रमुख सीमाएँ हैं। सबसे पहले, भुखमरी चूहों में खाद्य प्रतिबंध के 48 घंटा प्रभावी रूप से पशुओं में भोजी प्रेरित करने के लिए एक लंबी अवधि लेता है, जैसे,सबसे अंगों में। दूसरा, भुखमरी मुश्किल से मस्तिष्क भोजी लाती है, मस्तिष्क में एक अपेक्षाकृत स्थिर पोषक तत्वों की आपूर्ति की वजह से। वास्तव में, यह भी छोटे अणु inducers द्वारा भोजी प्रेरण पता लगाने के लिए कई दवाओं रक्त मस्तिष्क बाधा पार नहीं कर सकता के रूप में मुश्किल है। इस प्रकार, बेहतर रोग रोगजनन में भोजी सक्रियण के समारोह का विश्लेषण करने के लिए, हमने हाल ही में पता चला व्यायाम के लिए समय 7, 8, 9 की एक छोटी अवधि में भोजी प्रेरित करने के लिए एक अधिक शक्तिशाली शारीरिक विधि है। भुखमरी के साथ तुलना में, भोजी प्रभावी ढंग से ट्रेडमिल के रूप में तेजी के रूप में 30 मिनट चल रहा है से प्रेरित है। इस प्रकार, व्यायाम स्वास्थ्य लाभ मध्यस्थता और रोगों को रोकने में भोजी की व्यवस्था का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक और शक्तिशाली शारीरिक दृष्टिकोण है।
वहाँ कई भोजी गतिविधि का पता लगाने, LC3 और p62 सहित के लिए प्रोटीन मार्करों हैं। LC3 (microtubule जुड़े प्रोटीन 1 ए / 1 बी-सी प्रकाशHain 3) एक साइटोसोलिक प्रोटीन (LC3 है-मैं के रूप में) है कि भोजी प्रेरण पर पीई (phosphatidylethanolamine) संयुग्मित है। पीई lipidated LC3 (LC3-द्वितीय फार्म) autophagosomal झिल्ली पर भर्ती की है और जब GFP के साथ लेबल autophagosomes कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। cytosol माइक्रोस्कोपी के तहत autophagosomes के ढांचे कबरा से इसकी translocation भोजी प्रेरण का एक संकेत है। p62 भोजी substrates (जैसे ubiquitination प्रोटीन के रूप में) के लिए एक मालवाहक रिसेप्टर है, और साथ ही autophagosomes में शामिल किया है। चूंकि प्रोटीन autophagosomes के साथ लाइसोसोम में अपमानित किया जाता है, अपने स्तर भोजी प्रवाह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यहाँ हम कैसे इन मार्कर का उपयोग करने के लिए विभिन्न माउस मजबूर व्यायाम (ट्रेडमिल) और स्वैच्छिक व्यायाम (पहियों चल रहा है) सहित एरोबिक व्यायाम, से प्रेरित ऊतकों में भोजी यों तो दिखा। उसी प्रक्रिया भी अन्य inducers के उपचार के बाद भोजी के vivo माप के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
भोजी एक catabolic प्रक्रिया है कि ऊर्जा प्रदान करता है और कोशिका द्रव्य घटकों या क्षतिग्रस्त अंगों की लाइसोसोमल गिरावट से cytotoxicity कम कर देता है। पढ़ रही भोजी सेलुलर homeostasis का विनियमन और तनाव की प्रतिक्रिया के तं?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Northwestern University Mouse Histology and Phenotyping Laboratoryfor technical support and assistance, and Noboru Mizushima (University of Tokyo) for providing GFP-LC3 transgenic mice. A. R. and C. H. were supported by the startup funds from Northwestern University and the grant from National Institutes of Health (DK094980).
Materials
| Treadmill | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Mouse running wheel | Super Pet | 100079365 | diameter 11.4 cm |
| Odometer | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Syringe pump | KD Scientific | KDS100 | |
| Fluorescence microscope | Nikon | Model: inverted microscope ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogenizer | IKA | 003737001 / Model: T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer |
| Mounting media | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 antibody | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 antibody | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2X Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al. BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy. Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).
- Mizushima, N., Komatsu, M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 147, 728-741 (2011).
- Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system. Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).
- Rocchi, A., He, C. Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders. Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).
- Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. Role of autophagy in cancer. Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).
- He, C., et al. Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis. Nature. 481, 511-515 (2012).
- He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain. Autophagy. 8, 4 (2012).
- Kuramoto, K., et al. Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids. Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).
- Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse. JoVE. , (2016).
- Navone, S. E., et al. Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells. Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).
- Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Bjørkøy, G., et al. Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1. Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).
- Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition). Autophagy. 12, 1-222 (2016).
- Levine, B., Kroemer, G. Autophagy in the Pathogenesis of Disease. Cell. 132, 27-42 (2008).
- Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
- Fang, Y., et al. Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice. Cell Metab. 17, 456-462 (2013).
- Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. Immunoregulatory functions of mTOR inhibition. Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).
- Miller, R. A., et al. Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction. Aging Cell. 13, 10 (2014).
- Grumati, P., et al. Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles. Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).
- Lira, V. A., et al. Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).
- Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity. Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).
- Kregel, K. C., et al. Resource book for the design of animal exercise protocols. American Physiological Society. , 152 (2006).
- Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. Interstrain variation in murine aerobic capacity. Med Sci Sports Exerc. 33, 5 (2001).
- Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running. The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).
- Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver. European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).
- Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle. J Appl Physiol. 84, 4 (1998).
- Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice. Can J Physiol Pharmacol. 71, 4 (1993).
