l'activation Autophagie est bénéfique dans la prévention d'un certain nombre de maladies. L' une des approches physiologiques pour induire autophagy in vivo est un exercice physique. Ici, nous montrons comment activer l'autophagie par l'exercice aérobie et de mesurer les niveaux de l'autophagie chez les souris.
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Article de méthode
Activation autophagie par exercice aérobie chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’autophagie est une voie de dégradation lysosomale essentielle à l’homéostasie, à la fonction et à la différenciation cellulaires. Dans des conditions de stress, l’autophagie est induite et cible diverses cargaisons, telles que le cytosol en vrac, les organites endommagés et les protéines mal repliées, pour la dégradation dans les lysosomes. Les molécules nutritives résultantes sont recyclées dans le cytosol pour la synthèse de nouvelles protéines et la production d’ATP. La régulation positive de l’autophagie a des effets bénéfiques contre la pathogenèse de nombreuses maladies, et des stratégies pharmacologiques et physiologiques pour activer l’autophagie ont été rapportées. L’exercice aérobique a récemment été identifié comme un inducteur d’autophagie efficace dans plusieurs organes chez la souris, notamment les muscles, le foie, le cœur et le cerveau. Ici, nous montrons des procédures pour induire l’autophagie in vivo par un exercice forcé sur tapis roulant ou une course volontaire à la roue. Nous démontrons également des méthodes microscopiques et biochimiques pour analyser quantitativement les niveaux d’autophagie dans les tissus de souris, en utilisant les protéines marqueurs LC3 et p62 qui sont transportées et dégradées dans les lysosomes avec les autophagosomes.
Introduction
L' autophagie est une voie de dégradation évolutivement conservée, qui est induite en réponse à diverses conditions de stress telles que la famine et de l' hypoxie 1, 2. Pendant l' autophagie, vésicules à double membrane, appelée autophagosomes, incorporer des composants subcellulaires inutiles ou endommagées et de les transporter dans les lysosomes de la dégradation 3. Autophagy basal est essentielle pour la fonction cellulaire et le développement de l' organisme, et une altération autophagy de base est impliqué dans de nombreux troubles, y compris la neurodégénérescen....
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Protocole
Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées conformément aux lignes directrices approuvées par le Institutional soin et l'utilisation des animaux Comité Northwestern University (IACUC).
1. Les modèles de souris
- Utilisez la souris 8-12 semaines d'âge dans la formation d'exercice. Pour détecter autophagy exercée induite in vivo en utilisant des souris transgéniques GFP-LC3 (C57BL / 6 de fond) pour des études d'imagerie et C57BL / 6 pour des analyses biochimiques.
2. L'autophagie induite par l'exercice
- Setup Treadmill - exercice forcé
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Résultats
Ce protocole décrit deux méthodes différentes pour induire l'autophagie dans les tissus de souris par l'exercice aérobie: un total de 90 min d'exercice forcé sur un tapis roulant à plusieurs voies procédé par deux jours de acclimation; ou deux semaines d'exercice volontaire sur une roue en cours d'exécution utilisé par les souris logés individuellement. Dans chaque protocole d'exercice, on peut mesurer le flux de autophagy par microscopie à fluorescence et une ana.......
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Discussion
L'autophagie est un processus catabolique qui fournit de l'énergie et réduit la cytotoxicité par la dégradation lysosomale des composants du cytoplasme ou organites endommagés. L'étude de l'autophagie est important de comprendre la régulation de l'homéostasie cellulaire et les mécanismes de réponse au stress. De nouveaux modèles et méthodologies émergent dans le domaine de la recherche 15, pour étudier comment l' autophagie altérée contribue à de nombreux processus patholo.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous remercions le Laboratoire d’histologie et de phénotypage de souris de l’Université Northwestern pour son soutien technique et son assistance, ainsi que Noboru Mizushima (Université de Tokyo) pour la fourniture de souris transgéniques GFP-LC3. A. R. et C. H. ont été soutenus par les fonds de démarrage de l’Université Northwestern et la subvention des National Institutes of Health (DK094980).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tapis de course | Columbus Instruments | 150-RM Exer 3/6 | |
| Souris Roue de course | Super Pet | 100079365 | diamètre 11,4 cm |
| Odomètre | Bell | DASHBOARD 100 | |
| Pompe à seringue | KD Scientific | KDS100 | |
| Microscope à fluorescence | Nikon | Modèle : microscope inversé ECLIPSE | |
| Cryostat | Leica | CM 1850UV | |
| Homogénéisateur | IKA | 003737001 / Modèle : T10 Basic S1 | |
| Chloroquine | CAYMAN CHEMICAL COMPANY | 14194 | |
| Parafolmaldehye | SIGMA-ALDRICH | P6148 | Equipement de protection individuelle requis. Ce produit peut libérer du formaldéhyde, un produit chimique connu pour causer le cancer. |
| Média de montage | Vector Laboratories | H-1200 | |
| p62 anticorps | BD Biosciences | 610833 | |
| LC3 anticorps | Novus Biologicals | NB100-2220 | |
| 2x Laemmli | Sample Buffer Bio-Rad | Laboratories 161-0737 | |
| ImageJ | NIH |
Références
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).
- Tracy, K., et al.
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Réimpressions et autorisations
