Aktivera Autophagy av aerob träning hos möss

Summary

Autophagy aktivering är fördelaktigt vid förebyggande av ett antal sjukdomar. En av de fysiologiska metoder för att inducera autophagy in vivo är fysisk träning. Här visar vi hur du aktiverar autophagy av aerob träning och mäta autophagy nivåer i möss.

Abstract

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced and targets various cargos, such as bulk cytosol, damaged organelles and misfolded proteins, for degradation in lysosomes. Resulting nutrient molecules are recycled back to the cytosol for new protein synthesis and ATP production. Upregulation of autophagy has beneficial effects against the pathogenesis of many diseases, and pharmacological and physiological strategies to activate autophagy have been reported. Aerobic exercise is recently identified as an efficient autophagy inducer in multiple organs in mice, including muscle, liver, heart and brain. Here we show procedures to induce autophagy in vivo by either forced treadmill exercise or voluntary wheel running. We also demonstrate microscopic and biochemical methods to quantitatively analyze autophagy levels in mouse tissues, using the marker proteins LC3 and p62 that are transported to and degraded in lysosomes along with autophagosomes.

Introduction

Autophagy är en evolutionärt konserverad nedbrytningsväg, som induceras som svar på olika stressförhållanden, såsom svält och hypoxi ^{1, 2.} Under autophagy, dubbel membranvesiklar, som kallas autophagosomes, införliva onödiga eller skadade subcellulära komponenter och transportera dem till lysosomer för nedbrytning ^3. Basal autophagy är avgörande för cellulär funktion och organismutveckling, och försämrad basal autophagy är inblandade i många störningar, inklusive neurodegenerering, tumörgenes och typ 2-diabetes ^{4, 5, 6.}

Den mest kända fysiologiska autophagy induceraren är svält. Det har dock två stora begränsningar. Först tar svält en lång tid för att effektivt inducera autophagy i djur, t.ex. 48 timmar av mat begränsning hos mössi de flesta organ. För det andra, svält inducerar knappt hjärn autophagy, på grund av en relativt stabil näringstillförsel i hjärnan. I själva verket är det också svårt att detektera autophagy induktion genom småmolekylära inducerare, eftersom många läkemedel inte kan passera blod-hjärnbarriären. Således, för att bättre analysera funktionen av autophagy aktivering i sjukdoms patogenes, upptäckte vi nyligen att motion är en mer potent fysiologisk metod för att inducera autophagy i en kort tidsperiod ^{7, 8, 9.} Jämfört med svält, är autophagy effektivt induceras av treadmill att köra så fort som 30 min. Således, är motion ett bekvämt och potent fysiologisk metod för att studera mekanismen för autophagy i medla hälsofördelar och förebygga sjukdomar.

Det finns flera proteinmarkörer för påvisande av autophagy-aktivitet, inklusive LC3 och p62. LC3 (mikrotubuli-associerat protein 1A / 1B-ljus chain 3) är ett cytosoliskt protein (LC3-I bildar) som är konjugerad till PE (fosfatidyletanolamin) på autophagy induktion. PE-lipiderade LC3 (LC3-II form) rekryteras på autophagosomal membran och kan användas för att visualisera autophagosomes när märkt med GFP. Dess translokation från cytosolen till punktat konstruktioner av autophagosomes enligt mikroskopi är en indikation på autophagy induktion. p62 är en last receptor för Autophagy substrat (t.ex. ubikitinering proteiner), och inkorporeras i autophagosomes också. Eftersom proteinet bryts ned i lysosomer tillsammans med autophagosomes, kan dess nivåer användas för att mäta den autophagy flux. Här visar vi hur man använder dessa markörer för att kvantifiera autophagy i olika mus vävnader induceras av aerob träning, inbegripet tvångs övning (treadmill) och frivillig träning (löphjul). Samma förfaranden kan också tillämpas på in vivo mätning av autophagy efter behandling av andra inducerare.

Protocol

Alla som deltar i djurförsök utfördes enligt riktlinjer som godkänts av Northwestern University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC). 1. musmodeller Använd 8-12 veckor gamla möss i träning. För att detektera utövas-inducerad autophagy in vivo, använda GFP-LC3 transgena möss (C57BL / 6 bakgrund) för avbildningsstudier och C57BL / 6-möss för biokemiska analyser. 2. Motion-inducerad Autophagy Löpband set…

Representative Results

Detta protokoll beskriver två olika metoder för att inducera autophagy i mus vävnader genom aerob träning: totalt 90 min tvångs motion på en flerfiliga löpband föregås av två dagars acklimatisering; eller två veckors frivillig övning på en löphjul som används av enkel inrymt möss. I varje övningsprotokollet, kan vi mäta autophagy flödet genom fluorescensmikroskopi och western blot-analys i olika organ. Vi an…

Discussion

Autophagy är en katabolisk process som ger energi och minskar cytotoxicitet genom lysosomal nedbrytning av cytoplasma komponenter eller skadade organeller. Studerar autophagy är viktigt att förstå regleringen av cellulär homeostas och mekanismerna för stressrespons. Nya modeller och metoder växer fram inom forskningsområdet ^15, för att studera hur nedsatt autophagy bidrar till många patologiska processer ^{16, 17.}

<p class="jo…

Materials

Treadmill	Columbus Instruments	150-RM Exer 3/6
Mouse running wheel	Super Pet	100079365	diameter 11.4 cm
Odometer	Bell	DASHBOARD 100
Syringe pump	KD Scientific	KDS100
Fluorescence microscope	Nikon	Model: inverted microscope ECLIPSE
Cryostat	Leica	CM 1850UV
Homogenizer	IKA	003737001 / Model: T10 Basic S1
Chloroquine	CAYMAN CHEMICAL COMPANY	14194
Parafolmaldehye	SIGMA-ALDRICH	P6148	Personal protection equipment required. This product may release formaldehyde gas, a chemical known to cause cancer
Mounting media	Vector Laboratories	H-1200
p62 antibody	BD Biosciences	610833
LC3 antibody	Novus Biologicals	NB100-2220
2X Laemmli Sample Buffer	Bio-Rad Laboratories	161-0737
ImageJ	NIH