यह पांडुलिपि phagosomal पीएच और क्षेत्र के साथ-साथ ratiometric सूचक seminaphthorhodafluor (snarf) -1, या एस -1 का उपयोग करते हुए मानव और माउस न्यूट्रोफिल की cytoplasmic पीएच मापने के लिए एक सरल विधि का वर्णन है। इस लाइव सेल कोंफोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण का उपयोग हासिल की है।
न्यूट्रोफिल सहज रक्षा की मेजबानी के लिए महत्वपूर्ण हैं, परिणामस्वरूप, चिकित्सा अनुसंधान का एक महत्वपूर्ण क्षेत्र का गठन। फेगोसोम, intracellular कम्पार्टमेंट जहां हत्या और घिरा हुआ कणों के पाचन जगह ले, न्युट्रोफिल रोगज़नक़ हत्या कि तंग विनियमन की आवश्यकता है के लिए मुख्य क्षेत्र है। Phagosomal पीएच एक पहलू यह है कि ध्यान से नियंत्रित किया जाता है रोगाणुरोधी प्रोटीज गतिविधि को विनियमित करने बारी में, है। कई फ्लोरोसेंट पीएच के प्रति संवेदनशील रंगों phagosomal पर्यावरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। एस -1 अपनी दोहरी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, फोटो विरंजन के लिए अपनी प्रतिरोध, और इसकी उच्च pKa सहित अन्य pH- संवेदनशील रंजक, पर कई फायदे हैं। इस विधि का उपयोग करना, हम दिखा दिया है कि न्युट्रोफिल फेगोसोम अन्य फ़ैगोसाइट की तुलना में असामान्य रूप से क्षारीय है। डाई के विभिन्न जैव रासायनिक conjugations का उपयोग करके, फेगोसोम कोशिका द्रव्य से चित्रित किया जा सकता है ताकि आकार और फेगोसोम के आकार में परिवर्तन का आकलन किया जा सकता है। यह च की अनुमति देता हैया आयनिक आंदोलन की आगे की निगरानी।
न्युट्रोफिल शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में सहज प्रतिरक्षा सेल है। इसका मुख्य कार्य खून गश्त और छा और विदेशी कणों कि यह phagocytosis 1, 2 के रूप में जाना प्रक्रिया में सामना कर सकते हैं पचाने के होते हैं। कणों फेगोसोम नामक एक intracellular डिब्बे में अपमानित कर रहे हैं। न्युट्रोफिल एनएडीपीएच ऑक्सीकारक, isoform NOX2, की सक्रियता के जैव रासायनिक प्रतिक्रियाओं का एक झरना है कि रोगज़नक़ की मौत में खत्म आरंभ करता है। NOX2 प्रोटीन सबयूनिट्स phagosomal झिल्ली 3 में एक इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला जटिल बनाने के लिए आगे बढ़ें। एक बार सक्रिय, यह इलेक्ट्रॉनों फेगोसोम अंदर आणविक ऑक्सीजन के लिए झिल्ली भर एनएडीपीएच से transports, सुपरऑक्साइड anions और आगे प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों का निर्माण किया। यह श्वसन फट रूप में जाना जाता है, और यह कुशल माइक्रोबियल हत्या और पाचन 2 के लिए आवश्यक माना जाता है </sup>। हालांकि, झिल्ली भर में नकारात्मक चार्ज के इस अनन्य आंदोलन जल्द ही NOX2 निष्क्रिय अगर यह सकारात्मक चार्ज द्वारा में आगे बढ़ और / या नकारात्मक चार्ज फेगोसोम से बाहर जाने के लिए मुआवजा नहीं कर रहे थे। यह अच्छी तरह से स्थापित किया गया है कि न्युट्रोफिल में आरोप मुआवजा के बहुमत प्रोटॉन चैनल HVCN1 4, 5 द्वारा किया जाता है। इस चैनल फेगोसोम में साइटोसोल से उनके विद्युत ढाल नीचे प्रोटॉन की निष्क्रिय आंदोलन के लिए अनुमति देता है। प्रोटॉन एकाग्रता पीएच से परिलक्षित होता है, इसलिए oxidase गतिविधि का एक दिया स्तर के लिए, फेगोसोम में पीएच मापने प्रभारी मुआवजे में protonic और गैर protonic रास्ते में से रिश्तेदार की भागीदारी के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं।
मानव न्युट्रोफिल फेगोसोम phagocytosis 5 के बाद लगभग 8.5 20-30 मिनट के लिए की एक क्षारीय पीएच है। यह NOX में अतिरिक्त गैर-प्रोटॉन आयन चैनल के अस्तित्व का तात्पर्य2 प्रेरित प्रभारी मुआवजा, संलयन और अम्लीय कणिकाओं और HVCN1 से एकमात्र मुआवजा की सामग्री की रिहाई, एक अम्लीय वातावरण बनाए रखना होगा ने कहा कि के विपरीत है। आयनों के आंदोलन इस नकारात्मक चार्ज भी असमस के माध्यम से फेगोसोम आकार में परिवर्तन लागू हो सकता है क्षतिपूर्ति करने के लिए। उच्च शारीरिक सांद्रता में न्युट्रोफिल में मौजूद इन आयनों हो सकता है: पोटेशियम आयनों फेगोसोम 6 में ले जाने के लिए दिखाया गया है, और क्लोराइड आयनिक आंदोलन एक और उम्मीदवार न्युट्रोफिल समारोह 7 के लिए महत्वपूर्ण है।
फेगोसोम में पीएच के विनियमन रोगाणुरोधी प्रोटीज गतिविधि 5 के लिए महत्वपूर्ण है। Myeloperoxidase (MPO) 6 पीएच पर इष्टतम गतिविधि है, जबकि cathepsin जी और इलास्टेज के लिए, इष्टतम स्तर को पीएच 7-9 और पीएच 8-10 कर रहे हैं, क्रमशः 5 प्रकट होता है। इसलिए, phagosomal पीएच में क्षणिक परिवर्तन मज़ा करने के लिए विभिन्न एंजाइमों के लिए गतिविधि आलों प्रदान कर सकता हैction। समझना कैसे पीएच न्युट्रोफिल माइक्रोबियल हत्या में शामिल है उपन्यास न्युट्रोफिल-बढ़ाने माइक्रोबियल एजेंट के डिजाइन के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं।
न्युट्रोफिल फेगोसोम एक उच्च प्रतिक्रियाशील माहौल है। यह, यह मुश्किल सही रूप में पीएच आकलन करने के लिए बनाता है क्योंकि रंगों को आसानी से ऑक्सीकरण जा सकता है, तकनीकी कलाकृतियों के लिए अग्रणी। ऐतिहासिक रूप से, fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) पसंद के रंग intracellular पीएच 8, 9 को मापने के लिए किया गया है। हालांकि, वहाँ न्युट्रोफिल phagosomal पीएच को मापने में इसके उपयोग के लिए कुछ नुकसान कर रहे हैं। यह अर्थ है कि यह केवल सही ढंग से, 5 से 7.5 से 8 पीएच स्तर को आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता के रूप में यह पीएच <8 से 11 पर संतृप्त, 6.4 10 का एक pKa है। न्युट्रोफिल phagosomal पीएच बहुत अधिक क्षारीय 5 बन सकता है के रूप में, FITC संभावित पीएच परिवर्तन की पूरी रेंज पर कब्जा नहीं कर सकते हैं। एक और महत्वपूर्णन्यूट्रोफिल के संदर्भ में FITC के साथ नहीं कर सकते समस्या यह है कि यह MPO 12 से photobleached माना जाता है। MPO अवरोध करनेवाला, सोडियम azide, 13 photobleaching सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह दिखाया गया है कि सोडियम azide सीधे एक MPO स्वतंत्र ढंग से phagosomal पीएच कम करती है और इस तरह इस तरह के assays 5 में उपयोग के लिए अनुपयुक्त है।
अन्य intracellular रंगों की तुलना में, एस -1 7.5 10 का एक अपेक्षाकृत उच्च pKa है। अम्लीय परिस्थितियों में, अणु protonated है और जब 488 एनएम या इसके बाद के संस्करण पर उत्साहित 560 और 600 एनएम के बीच एक उत्सर्जन संकेत पैदा करता है। जब अणु अधिक क्षारीय परिस्थितियों में deprotonated है, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 600 एनएम खत्म हो गया है। इन दोनों तरंगदैर्य पर प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक अनुपात, उत्सर्जन पारी है, जो अधिक एकल प्रतिदीप्ति माप से विश्वसनीय है इंगित करता है के रूप में यह फ्लोरोफोरे एकाग्रता और कोशिका की संरचना से अप्रभावित है। एस -1, इस तरह के zymosan 14 के रूप में, प्रतिजनी सामग्री को संयुग्मित किया जा सकता है, हालांकि गर्मी को मार डाला (हांगकांग) कैंडिडा एल्बीकैंस पसंद किया जाता है के रूप में बड़े सतह क्षेत्र अधिक सुसंगत प्रतिदीप्ति पढ़ने देता है।
हम यह भी पीएच में अस्थायी परिवर्तन (चित्रा 3) 5 अध्ययन करने के लिए इस विधि का एक संशोधन का इस्तेमाल किया है। साइटोसोलिक पीएच की माप के लिए इस विधि को आसानी से, के रूप में कहीं अधिक क्षारीय phagosomes 14 के साथ वर्णित 15, 16, और कोशिकाओं अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है।
एक बार जब उचित अभिकर्मकों, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स, और अंशांकन प्रयोगों स्थापित कर रहे हैं, इस विधि अपेक्षाकृत प्रदर्शन करने के लिए सरल है। महत्वपूर्ण चरणों में शामिल हैं: एस -1 के साथ कैंडिडा लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए डाई का कोई अधिक भार है कि वहाँ, कैलिब्रेट, और छवि का विश्लेषण।
एस -1 एक अभिकर्मक अधिक क्षारीय पीएच वातावरण के लिए अनुकूल है, जो न्यूट्रोफिल 21 के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, लेकिन कुछ प्रकार की कोशिकाओं में इसके उपयोग को सीमित करता है। इस तरह के बृहतभक्षककोशिका phagosomes, Snarf -4, या एस -4 के रूप में अधिक अम्लीय वातावरण, के लिए, इसकी कम pKa 22 की वजह से अधिक उपयुक्त है। इसके अलावा, अधिक सटीक cytoplasmic रीडिंग के लिए, यह बेहतर एस -4 का उपयोग करने, एस -1 के लिए मानक वक्र के रूप में पता चलता है कि प्रतिदीप्ति अनुपात 6 पीएच नीचे पठार करने के लिए शुरू (चित्रा 3) है। अन्य रंजक, जैसे 2 ', 7'-Bis- (2 carboxyethyl) -5 (और -6) -Carboxyfluorescein (BCECF) या pHrodo लाल भी एक शेष भाग में अधिक उपयुक्त हो सकता हैext कि अम्लीय होने की उम्मीद है। फिर भी कोशिका द्रव्य धुंधला अभी भी कैंडिडा युक्त phagosomes की सही पहचान के लिए आवश्यक है।
एक phagosomal पीएच सूचक की एक महत्वपूर्ण विशेषता है कि यह अपरिवर्तनीय प्रतिक्रियाशील phagosomal पर्यावरण से परिवर्तित नहीं होता है। एस -1 न्युट्रोफिल वातावरण के लिए प्रतिरोधी हो रहा है। यह लेविन एट अल द्वारा दिखाया गया है। / – – न्युट्रोफिल 5 जो phagocytosis और एक एस -1 लेबल कैंडिडा कण के बाद रिहाई एक Hvcn1 द्वारा प्रदर्शित (पूरक संदर्भ 5 वीडियो 4 देखें)। जब phagocytosed, कण पीला / नारंगी लाल (क्षारीय पीएच तटस्थ) से बदल जाता है, लेकिन जब कण न्युट्रोफिल द्वारा जारी की है, यह अपने मूल रंग करने के लिए देता है।
यह एस -1 का उपयोग कर के साथ जुड़े सीमाओं में से कुछ का उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है। तथ्य यह है कि यह डाई ratiometric meas की इजाजत दी दो उत्सर्जन स्पेक्ट्रा हैurement एक फायदा है, लेकिन विशेषज्ञ उपकरण चित्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है; प्रयोगों में प्रयुक्त किये माइक्रोस्कोप दो छवियों एक साथ या एक तुच्छ समय देरी से रिकॉर्ड करने के लिए सक्षम होना चाहिए। लेखकों को लगता है कि शोधकर्ता इस प्रोटोकॉल का प्रयास कर कोंफोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अनुभव है, या एक प्रशिक्षित पेशेवर की पहुंच है। हम सभी विशिष्ट माइक्रोस्कोप मापदंडों की सूची नहीं कर सकते हैं के रूप में वे एक खुर्दबीन के लिए अलग और शोधकर्ता द्वारा अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी। acetoxymethyl एस्टर एस -1 के लिए संयुग्मित कि डाई सेल कोशिका द्रव्य में फैलाना करने की अनुमति देता सेल कोशिका द्रव्य में गैर विशिष्ट esterases से अपमानित किया जाता है फ्लोरोसेंट अणु के रूप में। ऐसे alkaline फॉस्फेट के रूप में esterases,, मानव सीरम और भ्रूण गोजातीय सीरम, जो सेल संस्कृति मीडिया के पूरक के लिए उपयोग किया जाता है में मौजूद हैं। तदनुसार, माध्यम है जिसमें कोशिकाओं एस -1-AM (खंड 4.5) के साथ लोड किए गए हैं सीरम नहीं होनी चाहिए। यदि कोशिकाओं है कि एक और अधिक पोषक तत्वों से रिक की आवश्यकता का उपयोग कर इस चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता हैज मध्यम इस प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया संतुलित नमक के घोल से उन्हें बनाए रखने के लिए। इसी प्रकार, इस तरह के फिनोल लाल के रूप में अन्य फ्लोरोसेंट मध्यम घटकों, एस -1 माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं।
3 चित्र में त्रुटि सलाखों से संकेत मिलता है प्रत्येक पीएच पर अनुपात माप में कुछ बदलाव नहीं है। प्रत्येक प्रयोग की पुनरावृत्ति की एक उपयुक्त संख्या (कम से कम n = 3) और प्रत्येक एकल प्रयोग में के रूप में कई अलग-अलग माप अंतर-vacuolar भिन्नता को दूर करने के लिए आवश्यक हैं। यह इस प्रकार के रूप में कई phagosomal क्षेत्रों है कि केवल एक कैंडिडा को रोकने के लिए दिखाई प्रत्येक शर्त के लिए कम से कम 100 phagosomes और का पीएच को मापने के लिए सलाह दी जाती है। Phagosomes quantitation उन है कि पूरी तरह से एक कैंडिडा कण (यानी, उन पूरी तरह से कोशिका द्रव्य से घिरा हुआ) घिरा हुआ है किया जाना चाहिए के लिए मापा जाना चाहिए। quantitation के लिए कोशिकाओं / phagosomes के चयन में अनजाने में पूर्वाग्रहों को कम करने के, सभी विश्लेषण करते हुए प्रदर्शन किया जाना चाहिएप्रयोगात्मक शर्तों को अंधा।
यहाँ, हम पूरे रक्त एक घनत्व ढाल के माध्यम से प्लाज्मा परत की centrifugation द्वारा पीछा के dextran अवसादन द्वारा न्यूट्रोफिल के अलगाव का वर्णन। हम इस तकनीक का प्रयोग के रूप में यह जल्दी से और कुशलता न्यूट्रोफिल का एक शुद्ध (> 95%) आबादी का उत्पादन, हालाँकि अन्य घनत्व ढाल सूत्रों या एंटीबॉडी या चुंबकीय के साथ विशेषज्ञ किट का उपयोग कर न्यूट्रोफिल के नकारात्मक चयन के माध्यम से पूरे रक्त centrifugation के रूप में अन्य तरीकों उपलब्ध हैं, मोती। हालांकि, बाद के अधिकांश समूहों जो न्यूट्रोफिल नियमित अलग के लिए महंगे हो सकता है। इसके अलावा, हम रक्त एकत्रित ट्यूब में थक्कारोधी हेपरिन उपयोग करते हैं, जबकि अन्य शोधकर्ताओं ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) या एसिड साइट्रेट सोडियम (एसीडी) का उपयोग करने के लिए और अधिक आदी हो सकता है। वहाँ कई अलग अलग तरीके से चुनने के लिए कर रहे हैं, यह शोधकर्ता की व्यक्तिगत पसंद पर निर्भर है।
इसके अलावा,जब अलग और न्यूट्रोफिल से छेड़छाड़ वे अत्यधिक सक्रियण से बचने के लिए कुछ देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। एहतियाती कदम शामिल हैं: केवल प्लास्टिक बर्तन का उपयोग कर, कोई गिलास; फ़िल्टर कर-नसबंदी सभी बफ़र्स किसी भी contaminating अन्तर्जीवविष दूर करने के लिए; जब कताई न्यूट्रोफिल यकीन अपकेंद्रित्र अच्छी तरह से अत्यधिक कंपन से बचने के लिए संतुलित है बनाते हैं; से कम समय न्यूट्रोफिल centrifugation के बाद एक गोली में रहते हैं जितना की सीमा; अधिक से अधिक 5 x 10 6 / एमएल के समाधान में न्यूट्रोफिल नहीं बनाए रखते हैं; और अलगाव के बाद जितनी जल्दी हो सके प्रयोग करते हैं।
के रूप में अंशांकन चरणों के लिए वर्णित इस विधि, खुर्दबीन पर 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक गर्म मंच सेट का उपयोग और एक ही स्थिति से एक बार हर 30-60 रों स्नैपशॉट लेने के द्वारा समय के साथ पीएच और phagosomal क्षेत्र में परिवर्तन को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। यह भी सैद्धांतिक रूप से इस तरह के 96-अच्छी तरह प्लेटों में के रूप में उच्च throughput प्रयोगों, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और प्रयोगों प्रवाह cytometry के लिए है, जहां एस -1 कर सकते हैंएक pH इंडिकेटर 23 के रूप में इस्तेमाल किया जा। हालांकि, इन स्थितियों में, अलग-अलग सेल गतिविधि पर जोर देने के सेल आबादी पर एक अधिक वैश्विक प्रभाव से बदल दिया है।
इस विधि एक अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक सेटअप जिस पर अलग-अलग शोधकर्ताओं हित के अपने क्षेत्र के अनुरूप करने के लिए अनुकूलित कर सकते हैं प्रदान करना है। शोधकर्ताओं ने जब भी अन्य आयनों के आंदोलन को मापने, उदाहरण के लिए, intracellular कैल्शियम एकाग्रता के लिए न्युट्रोफिल phagosomal पीएच और क्षेत्र का पता लगाने कर सकते हैं। वहाँ कई फ्लोरोसेंट सीए 2 + इस तरह भारत-1 है, जो भी 400 और 475 एनएम 24 पर दोहरी उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के रूप में संकेतक कोंफोकल माइक्रोस्कोपी के लिए आसानी से उपलब्ध हैं। ये उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य एस -1 उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के साथ ओवरलैप नहीं है, लेकिन उत्तेजना तरंगदैर्ध्य स्पेक्ट्रम, कोशिकाओं के लिए हानिकारक जा सकती है, जिनमें से पराबैंगनी (यूवी) अंत में है, और एक यूवी लेजर सब सूक्ष्मदर्शी पर आम नहीं है। करने के लिए विभिन्न संकेतकों की एक व्यापक समीक्षामापने के intracellular कैल्शियम प्रवाह ताकाहाशी एट अल द्वारा कवर किया जाता है। 25 और Hillson एट अल। 26।
अंत में, वहाँ अन्य तरीकों Nunes एट अल के रूप में विभिन्न फ्लोरोसेंट रंजक का उपयोग कर phagosomal पीएच को मापने के लिए उपलब्ध हैं। 13 के साथ-साथ अन्य समूहों 27, 28 का प्रदर्शन किया है। अन्य शोधकर्ताओं ने यह भी एस -1 का इस्तेमाल किया है साइटोसोलिक पीएच 29 या phagosomal पीएच 14 को मापने के लिए। / – – हालांकि, इस प्रोटोकॉल एक साथ दोनों साइटोसोल और फेगोसोम का पीएच, जो phagosomal पार-अनुभागीय क्षेत्र में परिवर्तन का पालन करने के लिए और wildtype और Hvcn1 के बीच अंतर करने का अवसर प्रदान करता मापने में अद्वितीय है माउस न्यूट्रोफिल, और के साथ और एक के बिना मानव न्यूट्रोफिल एनएडीपीएच ऑक्सीकारक काम कर रहे।
The authors have nothing to disclose.
इस काम कृपया वेलकम ट्रस्ट, जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद, और इर्विन जोफ़ मेमोरियल फैलोशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया।
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |