Accident vasculaire cérébral ischémique est un événement complexe dans laquelle l’apport spécifique des astrocytes dans la région du cerveau touchée exposés au manque d’oxygène de glucose (AMG) est difficile à étudier. Cet article présente une méthode pour obtenir des astrocytes isolés et étudier leur réactivité et leur multiplication dans des conditions de ministères.
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Article de méthode
Surveillance des astrocytes réactivité et prolifération in Vitro dans des Conditions de type ischémique
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Accident vasculaire cérébral ischémique est un complexe crânien provoqué par un thrombus ou embolie entrave à la circulation sanguine vers les parties du cerveau. Cela conduit à la privation d’oxygène et de glucose, ce qui provoque la défaillance de l’énergie et la mort neuronale. Après une insulte d’accident vasculaire cérébral ischémique, astrocytes devient réactifs et prolifèrent autour du site de la lésion qu’il développe. Selon ce scénario, il est difficile d’étudier la contribution spécifique des astrocytes dans la région de cerveau exposé à l’ischémie. Par conséquent, cet article présente une méthodologie pour étudier la réactivité primaire astrocyte et prolifération dans un modèle in vitro d’un environnement de type ischémie, appelé la privation d’oxygène glucose (AMG). Les astrocytes ont été isolés de 1 à 4 jours-vieux rats néonatals et le nombre de cellules astrocytaires non spécifique a été évaluée à l’aide du marqueur sélectif astrocyte gliale fibrillaire acide protéine (GFAP) et la coloration des noyaux. La période dans laquelle astrocytes sont soumis à la condition de l’AMG peut être personnalisée, ainsi que le pourcentage d’oxygène, qu'ils sont exposés. Cette souplesse permet aux scientifiques de caractériser la durée de la condition de type ischémique dans différents groupes de cellules in vitro. Cet article explique les délais d’AMG qui induisent la réactivité de l’astrocyte, morphologie hypertrophique et prolifération telle que mesurée par l’immunofluorescence utilisant prolifèrent Cell Nuclear Antigen (PCNA). En plus de la prolifération, astrocytes subissent l’énergie et du stress oxydatif et de répondent aux autres ministères en libérant des facteurs solubles dans le milieu cellulaire. Ce moyen de communication peut être collecté et utilisée pour analyser les effets des molécules libérées par les astrocytes dans des cultures primaires de neurones sans interaction cellule-cellule. En résumé, ce modèle de culture cellulaire primaire peut être utilisé efficacement pour comprendre le rôle des astrocytes isolés sur blessure.
Introduction
Accident vasculaire cérébral est défini comme « un dysfonctionnement neurologique aiguë d’origine vasculaire avec développement rapid ou soudain des symptômes et des signes, correspondant à la participation des principaux domaines d’action dans le cerveau »1,2. Il existe deux types d’AVC : hémorragique et ischémique. Lorsque la dysfonction vasculaire est causée par un anévrisme ou une défectuosité artério-veineuse, accompagné d’affaiblissement postérieur de rupture d’une artère, il s’agit alors d’accident vasculaire cérébral hémorragique3 qui, dans la plupart des cas, conduit à la mort.....
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Protocole
postnatals rats (rats Sprague Dawley) 1-4 jours vieux sont utilisés pour isoler le cortex. La méthode d’euthanasie est décapitation, tel qu’approuvé par le NIH guidelines.
1. préparation des Instruments et matériaux pour chirurgie
- instruments de stériliser à l’autoclave (température : 121 ° c, pression : 15 psi, temps : 30 minutes) à l’aide d’une boîte en acier ou un instant sachet de stérilisation d’étanchéité. Voir des matières Table des matières.
2. Compléter DMEM préparation
- dans un bécher d’un litre contenant 700 mL d’eau stérilisés à l’autoclave, ajoutez Dulbec....
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Résultats
Une des principales préoccupations de culture astrocytaires primaire est la présence d’autres cellules comme les neurones, oligodendrocytes, les fibroblastes et des cellules microgliales. Dans la Figure 1, les cellules isolées des cortex de rat avaient milieu change tous les 3 jours et étaient soit non traités ou traités avec ajouté LME pendant 1 h. 24 h plus tard, les cellules ont été immunomarquées pour GFAP et Eosine au DAPI. Cellules non traitées ont mont.......
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Discussion
Ce protocole décrit l’isolement des astrocytes des cortex de rat. Dans cette méthode, il est essentiel pour diminuer la contamination avec d’autres types cellulaires comme les microglies, oligodendrocytes et fibroblastes. Pour réduire le nombre de cellules microgliales, plusieurs mesures peuvent être prises : changer les médias, orbitale secouant et traitements chimiques. Une fois que la pureté de la culture est confirmée par immunofluorescence à l’aide de marqueurs cellulaires sélectifs ou pour les principaux contaminan.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs veulent remercier Paola López Pieraldi pour l’assistance technique. A.H.M. est reconnaissante pour les subventions 8G12MD007600 et U54-NS083924 pris en charge de cette publication. Nous remercions NIH-NIMHD-G12-MD007583 subvention pour la prise en charge de l’installation. D.E.R.A. est reconnaissante de la bourse de recherche fourni par NIHNIGMS-R25GM110513. Nous sommes reconnaissants pour l’utilisation de l’espace commun d’Instrumentation et de l’aide du Dr Priscila Sanabria pour l’utilisation de la facilité d’imagerie optique du programme RCMI par grant G12MD007583. En outre, nous tenons à remercier Jose Padilla pour son rôle remarquable dans le tournage....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Instruments pour la chirurgie - Étape 1 | |||
| Ciseaux opératoires 5.5" | Roboz Company | RS-6812 | Outils utilisés pour décapiter les rats. |
| Pince incurvée 7" ; | Roboz Company | RS-5271 | Maintient la peau du rat pendant que le crâne est retiré. |
| Ciseaux de micro-dissection 4" ; | Roboz Company | RS-5882 | Coupe à la fois la peau et le crâne du rat. |
| Pince à micro-dissection 4" coudée, fine tranchante ; | Roboz Company | RS-5095 | Maintient la peau du rat pendant que le crâne est retiré. |
| Micro-pince à dissection 4" légèrement incurvée 0.8 | Roboz Company | RS-5135 | Outil utilisé pour séparer les cortex. |
| Pince à épiler micro-dissection | Roboz Company | RS-4972 | Peels méninges cérébrales. |
| Microscope de dissection | Olympus | SZX16 | Important pour l’élimination de la méninge des cortex. |
| Préparation DMEM - étape 2 | |||
| Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM) | GibCo. Entreprise | 11995-065 | Soutient la croissance des cellules. |
| Bicarbonate | de sodium Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplément pour les milieux de culture cellulaire. |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | GibCo. Entreprise | 10437-010 | Sérum-supplément pour la culture cellulaire. |
| Pénicilline-Streptomycine ; | GibCo. Entreprise | 15140-148 | Inhibe la croissance des bactéries dans la culture cellulaire. |
| Système de filtration 1L avec pores de 0,22um | Corning | 431098 | |
| Culture d’astrocytes - étape 3 | |||
| Pipettes sérologiques 5mL | VWR | 89130-896 | Pour pipeter le DMEM dans des récipients avec des cellules. |
| Pipettes sérologiques 10mL | VWR | 89130-898 | Pour pipeter le DMEM vers des récipients avec des cellules. |
| Pipettes sérologiques 25mL | VWR | 89130-900 | Pour pipeter DMEM vers des récipients avec des cellules. |
| Centrifugeuse tube conique 15mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-200250 | |
| Tube Safe-lock 1.5mL | Eppendorf | 022363204 | |
| Barrier Tips 200 uL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201725 | |
| Barrier Tips 1 mL | Santa Cruz Biotechnology | sc-201727 | |
| Biohazard Orange Bag 14 x 19" | VWR | 14220-048 | |
| Boîtes de Pétri de 60 mm | Falcon | 351007 | |
| Compresses de gaze stériles | Honeywell Safety | 89133-086 | |
| Stomacher 80 Biomaster | Sewar Lab System | 030010019 | Triturer le tissu cérébral. |
| Stomacher 80 Blender Sacs stériles | Sewar Lab System | BA6040 | Sac stérile pour l’homogénéisateur de cellules stomacher. |
| Bécher 400mL | Pyrex | 1000 | |
| Tamis stérile de dissociation cellulaire, maille #60 ; | Sigma-Aldrich Company | S1020 | Pour obtenir une suspension unicellulaire uniforme. |
| Tamis stérile à dissociation cellulaire, maille #100 | Sigma-Aldrich Company | S3895 | Pour obtenir une suspension unicellulaire uniforme. |
| Microscope à phase inversée | Nikon | Eclypse Ti-S | Vérifiez que les cellules ne sont pas contaminées ou qu’une croissance cellulaire anormale n’est pas observée. |
| Fioles stériles de 75 cm2 | Falcon | 353136 | |
| Plaque multi-puits | Falcon | 353046 | |
| Micro verres (lamelles), 18 mm, ronds | VWR | 48380-046 | |
| Hémacytomètre Bright-Line | Sigma-Aldrich Company | Z359629 | |
| Pipettes Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| Alcool éthylique ; | Sigma-Aldrich Company | E7023 | |
| Chlorhydrate d’ester méthylique de L-leucine 98 % (LME) | Sigma-Aldrich Company | L1002 | Favorise l’élimination des cellules microgliales dans la culture primaire de l’astrocyte cortical. |
| Cytosine &beta ;-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich Company | C1768 | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromure, mol weight 70,000-150,000 | Sigma-Aldrich Company | P0899 | |
| Trypsine/EDTA | GibCo. Entreprise | 15400-054 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich Company | T8154 | |
| Tampon de phosphate salin (PBS) comprimés | Calbiochem | 524650 | |
| Eau stérile | Sigma-Aldrich Company | W3500 | |
| ; OGD Medium Preparation - étape 5 | |||
| Centrifugeuse tube conique 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Dulbecco' Eagle modifié' s glucose moyennement libre | Sigma-Aldrich Company | D5030 | Soutient la croissance des cellules. |
| Bicarbonate | de sodium Sigma-Aldrich Company | S7277 | Supplément pour les milieux de culture cellulaire. |
| Pénicilline-Streptomycine ; | GibCo. Entreprise | 15140-148 | Inhibe la croissance des bactéries dans la culture cellulaire. |
| 200m ; L-glutamine ; | GibCo. Entreprise | 25030-081 | Acide aminé qui complète la croissance des cellules. |
| Tampon de phospahet salin (PBS) comprimés | Calbiochem | 524650 | |
| Système de filtration 50 ml avec pore de 0,22 um | Corning | 430320 | |
| Centrifugeuse à tube conique 50 mL | VWR | 89039-658 | |
| Débitmètre simple ; | Billups-Rothenberg | SMF3001 | Mesurer le débit de gaz dans la purge d’oxygène. |
| Chambre d’incubation d’hypoxie ; | StemCell | 27310 | Génère un environnement hypoxique pour la culture cellulaire. |
| Compteur d’oxygène dissous traçable | VWR | 21800-022 | |
| 95 % N2/ 5 % CO2 | Mélange gazeux Linde | Purge l’environnement de l’oxygène. | |
| <>Immunofluorescence astrocytaire primaire forte - étape 6 | |||
| Phosphate tampon salin (PBS) comprimés | Calbiochem | 524650 | |
| Formaline Solution neutre 10 % | Sigma-Aldrich | HT501128 | Solution utilisée pour fixer les cellules. |
| Méthanol ; | Fisher | A4544 | Solution utilisée pour fixer les cellules. |
| Surfactant non ionique (Triton X-100) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | GibCo. Entreprise | 10437-010 | Sérum-supplément pour la culture cellulaire. |
| Signalisation cellulaire | anti-NeuN | 24307 | Détecte les neurones matures, sert à valider la culture astrocytaire. |
| Signalisation cellulaire | anti-PCNA | 2586 | Détecte les cellules proliférantes. |
| Iodure de propidium (PI) | Sigma-Aldrich Company | P4170 | Coloration par apoptose. |
| Anti-Olig1 | Abcam | AB68105 | Détecte les oligodendrocytes matures. |
| Anti-Iba1+ | Wako | 016-20001 | Détecte les cellules microgliales. |
| Anti-GFAP conjugué à Cy3 ; | Sigma-Aldrich Company | C9205 | Détecte les astrocytes réactifs dans les cellules traitées. |
| Alexa Fluor 488 | Sonde moléculaire Life Technology | A1101 | Anticorps secondaire anti-souris. |
| Alexa Fluor 555 | Sonde moléculaire Life Technology | A21428 | Anticorps secondaire anti-lapin. |
| 4',6'-diamidino-2-phénylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich Company | D9542 | Coloration nucléaire. |
| Microscope confocal | Olympus |
Références
- Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. Interrater reliability of the NIH stroke scale. Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).
- Hinkle, J. L., Guanci, M. M. Acute ischemic stroke review. J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).
- Kassner, A., Merali, Z.
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Réimpressions et autorisations
