Spatiotemporal Analyse af Cytokinetic Begivenheder i Fission Gær

Summary

Den fission gær, Schizosaccharomyces pombe er en fremragende model til undersøgelse cytokinese, den sidste fase i celledeling. Her beskriver vi en mikroskopi tilgang til at analysere forskellige cytokinetic begivenheder i levende fission gærceller.

Abstract

Cytokinese, det sidste skridt i celledeling er afgørende for at opretholde genom integritet. Korrekt cytokinese er vigtig for celledifferentiering og udvikling. Cytokinese involverer en række begivenheder, der er godt koordineret i tid og rum. Cytokinese involverer dannelsen af ​​en actomyosin ring i division site, efterfulgt af ring konstriktion, membran fure dannelse og ekstracellulær matrix remodellering. Den fission gær, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er en velundersøgte modelsystem, der har afsløret med betydelig klarhed de indledende begivenheder i cytokinese. Men vi forstår ikke helt, hvordan forskellige cytokinetic begivenheder koordineres spatiotemporally. For at afgøre dette, er man nødt til at analysere de forskellige cytokinetic begivenheder i store detaljer i både tid og rum. Her beskriver vi en mikroskopi tilgang til at undersøge forskellige cytokinetic evenser i levende celler. Med denne fremgangsmåde er det muligt at tid forskellige cytokinetic begivenheder og bestemme tidspunktet for rekruttering af forskellige proteiner under cytokinese. Desuden beskriver vi protokoller til at sammenligne proteinlokalisering og distribution på stedet for celledeling. Dette er en grundlæggende protokol for at studere cytokinese i fission gær og kan også anvendes til andre gær og fungale systemer.

Introduction

Cytokinese, det sidste trin i celledeling, er en kompleks proces med henblik på forsvarlig differentiering, udvikling og overlevelse af en organisme. Cytokinese involverer flere hændelser, der er organiseret til at sikre en vellykket celleseparation samtidig bevare genomisk integritet ^1. Cytokinese involverer arrangementer, hvor en actomyosin ring er samlet undergår konstriktion, som er sideløbende med membran ekspansion og furer, og ekstracellulær matrix remodellering endelig efterfulgt af celle abscission ^{1, 2, 3.} Forkert organisering af cytokinetic hændelser kan føre til celle separations- og ploidi defekter, og kan forårsage sygdomme som kræft ^{4, 5, 6, 7, 8.} De grundlæggende principper, der muliggør organization af cytokinetic begivenheder er ikke godt forstået, hvilket fører til vejspærringer i vores forståelse af ætiologien af ​​disse sygdomme.

Den fission gær Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er en fremragende model til undersøgelse cytokinese grundet den konserverede beskaffenhed af de involverede ¹ proteiner. I fission gær, efter actomyosin ring samling, ringen ind i en modning / dvæle fase, hvor det ikke snøre ^9. Modning slutter med initiering af actomyosin ring konstriktion, samtidig med membran furer og septum indtrængen. Seminal arbejde gennem årene har givet os en rimelig god forståelse for actomyosin ring forsamling i fission gær ^{1, 9, 10.} I nogle eukaryoter, herunder fission gær, vellykket samling af actomyosin ring er ikke tilstrækkelig til membran furer. I fission gær, ring konstriktion alene giver ikke tilstrækkelig kraft til at overvinde intern saftspændingen for fure dannelse ^11. En nylig model indikerer, at denne kraft i stedet leveres af septum indtrængen ^11. I en anden model, har den rolle, plasmamembranen udvidelse blevet foreslået at bidrage til fure formation ^{12, 13.} Ring konstriktion og membran furer ikke forekommer i Bgs1 / CPS1 temperaturfølsom mutant cps1-191, de store enzym til primær septum dannelse ^{14, 15.} Celler, der mangler Bgs1 viser defekt primære septum og langvarig ring konstriktion ^{15, 16.} Bgs1 rekrutteres til celledeling site for septum indtrængen under modning efter actomyosin ring samling ^{17, 18.} Similarly, under cellularization i Drosophila embryoer, ring konstriktion er bifasisk med en signifikant langsom indledende konstriktion sats ^19, ligner modningsfasen observeret i fission gær. Bifasisk ring konstriktion kan bremse membran furer at give mulighed for tilstrækkelig membran udvidelse ²⁰ og ændring af ekstracellulær matrix. Dette antyder, at efter actomyosin ring samling, ring konstriktion sker effektivt, når cellen har opfyldt kravene for fure formation. Det er ikke godt forstået hvilke betingelser er nødvendige for actomyosin ring konstriktion efter ringsamlingen, eller de molekylære begivenheder, der regulerer denne proces. Vi har for nylig vist, at følgende actomyosin ring forsamling den lille GTPase Cdc42 gennemgår en unik Spatiotemporal aktivering mønster ^21. Dette mønster er etableret ved den unikke lokalisering mønster af cdc42 guanidin nukleotid exchange faktorer (GEFs), der aktiverer Cdc42. GEF Gef1 lokaliseres til den samlede actomyosin ring og fremmer indtræden af ​​ring konstriktion og septum indtrængen, mens SCD1 lokaliseres til furer membran og fremmer normal septum formation. Vi finder, at Cdc42 aktivering mønster indført ved dens GEFs fører til regulering af forskellige cytokinetic begivenheder.

For at forstå den molekylære mekanisme af begivenheder, der i sidste ende fører til celleseparation efter actomyosin ringsamlingen, er man nødt til at følge de forskellige cytokinetic begivenheder i tid og rum. I fission gær, cytokinese først involverer samling af precursor-knudepunkter omkring kernen, som i sidste ende rekrutterer type II myosin, den formin Cdc12, og andre proteiner, der er nødvendige for actomyosin ringaggregat. Til tid distinkte cytokinetic begivenheder og giver en referenceramme, er adskillelsen af spindel pole krop markører (spindel dannelse) betragtes som tiden 0 ^22. Samlingen af ​​the actomyosin ring kan følges ved overvågning over tid intensiteten af ​​en fluorescens mærkede actomyosin ring protein, såsom type II myosin regulatoriske let kæde Rlc1. Her beskriver vi en mikroskopisk fremgangsmåde til at analysere forskellige stadier af cytokinese over tid.

Protocol

1. Forberedelse af prøven Grow fission gærceller der udtrykker spindelpol-legemer markør Sad1-mCherry 23 og type II myosin regulatoriske let kæde Rlc1-Tomato 24 i YE flydende medier ved 32 ° C i 8 generationer. BEMÆRK: temperaturfølsomme mutanter, vokser celler ved 25 ° C. Grow celler til midten logaritmisk fase til en OD 600 på 0,5 i YE. For mere om fission betingelser gær vækst refererer til fission gær lab manual <sup class="xref…

Representative Results

Fission gærceller der udtrykker ringen markering, blev Rlc1-GFP (grønt, figur 2) og spindelpol-legemer markør Sad1-mCherry (rød, figur 2) afbildes under cytokinese. Indtræden af spindelpol-legemer markør (hvid pil, figur 2A, B) betragtes som tid 0. Rlc1-GFP signal vises på tidspunkt -4 minutter med henvisning til spindelpol-legemer separation (rød pil, figur 2A, 2B). Rlc1-GFP signal danner en kontinuerlig ring 10 min efter spinde…

Discussion

Her har vi beskrevet en protokol til at studere cytokinetic begivenheder i fission gær i en tidsmæssig måde. Den her beskrevne protokol giver tidsmæssige opløsning af forskellige cytokinetic begivenheder med henvisning til hinanden; timing af protein rekruttering eller tab med henvisning til cytokinetic fase; struktur af ringen i de forskellige faser af cytokinese; og progression af cytokinesen med henvisning til mitose. Med denne protokol er det muligt præcist at definere den cytokinetic fase, der kan ændres i f…

Materials

Yeast extract media	Sunrise Science Products	YES 225	0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine
Agarose	SeaKem LE agarose, Lonza	50001
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Glass Bottomed culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.
VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system	Visitech International, UK		with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).
ImageJ	NIH		Image analysis software