Spatiotemporal Analyse av Cytokinetic Hendelser i Fisjon Gjær

Summary

Fisjons gjær, er Schizosaccharomyces pombe en utmerket modellsystem for å studere cytokinese, den siste etappen i celledeling. Her beskriver vi en mikros tilnærming til å analysere ulike cytokinetic hendelser i levende fisjonsgjærceller.

Abstract

Cytokinese, er det siste trinnet i celledeling avgjørende for å opprettholde genom integritet. Riktig cytokinese er viktig for celledifferensiering og utvikling. Cytokinese innebærer en serie av hendelser som er godt koordinert i tid og rom. Cytokinese innebærer dannelsen av en actomyosin ring ved divisjon området, etterfulgt av ring innsnevring, membran fure formasjon og ekstracellulær matriks remodeling. Fisjons gjær, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er et godt studert modellsystem som har avdekket med betydelig klarhet de innledende hendelsene i cytokinese. Men vi forstår ikke helt klart hvordan ulike cytokinetic arrangementer koordineres spatiotemporally. For å finne ut dette, må man analysere de ulike cytokinetic hendelsene i flotte detaljer i både tid og rom. Her beskriver vi en mikros tilnærming til å undersøke forskjellige cytokinetic eventene i levende celler. Med denne tilnærmingen er det mulig å gang ulike cytokinetic hendelser og bestemme tidspunktet for rekruttering av ulike proteiner under cytokinese. I tillegg beskriver vi protokollene å sammenligne protein lokalisering og fordeling på stedet av celledeling. Dette er en grunnleggende protokollen for å studere cytokinese i fisjon gjær og kan også brukes for andre gjær og sopp-systemer.

Introduction

Cytokinese, det siste trinnet i celledeling, er en kompleks prosess avgjørende for riktig differensiering, utvikling og overlevelse av en organisme. Cytokinese involverer flere hendelser som er organisert for å sikre en vellykket celle separasjon og samtidig opprettholde genomisk integritet ^1. Cytokinese innebærer arrangementer hvor en actomyosin ring en gang samlet gjennomgår innsnevring, som er sammenfallende med membran ekspansjon og furrowing, og ekstracellulær matriks remodellering, til slutt etterfulgt av celle avsnøring ^{1, 2, 3.} Uriktig organisering av cytokinetic hendelser kan føre til celleseparasjons og ploidinummer defekter, og kan føre til sykdommer som kreft ^{4, 5, 6, 7, 8.} De grunnleggende prinsipper som muliggjør organization av cytokinetic hendelser er ikke godt forstått, og dermed fører til veisperringer i vår forståelse av etiologien av disse sykdommene.

Fisjons gjær Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) er et utmerket modellsystem for å studere cytokinese på grunn av den konserverte natur av de involverte ^en proteiner. I fisjon gjær, etter actomyosin ringsammenstillingen, går inn i ring et modnings / oppholdstid fase hvor det ikke innsnevre ^9. Modning ender med oppstart av actomyosin ring innsnevring, samtidig med membran furrowing og septum inntrengning. Banebrytende arbeid gjennom årene har gitt oss en ganske god forståelse av actomyosin ring montering i fisjon gjær ^{1, 9, 10.} I noen eukaryoter, inkludert gjær fisjon, er vellykket montering av actomyosin ringen ikke er tilstrekkelig for membran furrowing. i fission gjær, ring innsnevring alene ikke gir tilstrekkelig kraft til å overvinne indre turgor press for fure formasjon ^11. En fersk Modellen tilsier at denne kraften er i stedet gitt av septum inntrengning ^11. I en annen modell, har rollen til plasmamembranen forlengelse blitt foreslått for å bidra til dannelsen fure ^{12, 13.} Ring innsnevring og membranen furrowing ikke forekommer i Bgs1 / CPS1 temperaturfølsom mutant cps1-191, det viktigste enzymet for primær skillevegg formasjon ^{14, 15.} Celler som mangler Bgs1 viser defekt primære septum og forlenget ring innsnevring ^{15, 16.} Bgs1 er rekruttert til celledeling stedet for septum inntrengning under modning etter actomyosin ring montering ^{17, 18.} Similarly, under cellularization i Drosophila embryoer, er ring innsnevring bifasisk med en betydelig treg første innsnevring rente ^19, likner modningsfasen observert i fisjon gjær. Bifasisk ring innsnevring kan forsinke membran furrowing for tilstrekkelig membran utvidelse ²⁰ og modifikasjon av ekstracellulære matrise. Dette tyder på at etter actomyosin ring montering, oppstår ring innsnevring effektivt bare når cellen har oppfylt kravene til fure formasjon. Det er ikke godt forstått hvilke betingelser er nødvendige for actomyosin ring innsnevring etter ring montering, eller de molekylære hendelser som regulerer denne prosessen. Vi har nylig vist at følgende actomyosin ring forsamlingen den lille GTPase Cdc42 gjennomgår en unik spatiotemporal aktivitetsmønsteret ^21. Dette mønsteret er etablert av den unike lokaliseringen mønster av Cdc42 guanidin nukleotid utvekslings faktorer (GEFs) som aktiverer Cdc42. GEF Gef1 lokaliserer til den sammensatte actomyosin ring og fremmer utbruddet av ringen innsnevring og septum inntrengning, mens Scd1 lokaliserer til furrowing membran og fremmer normal septum formasjon. Vi finner at Cdc42 aktivering mønster etablert av sine GEFs føre til regulering av forskjellige cytokinetic hendelser.

For å forstå den molekylære mekanismen av hendelser som til slutt fører til celleseparasjon følgende actomyosin ring montering, må man følge de forskjellige cytokinetic hendelser i tid og rom. I fisjon gjær, cytokinese innebærer først montering av forløper noder rundt kjernen, som til slutt rekruttere type II myosin, det formin Cdc12, og andre proteiner som kreves for actomyosin ring montering. Til annen distinkte cytokinetic hendelser og gi en referanseramme, separasjon av spindel pol kropp markører (spindel Formasjonen) er regnet som tiden 0 ^22. Monteringen av the actomyosin ring kan følges ved å overvåke over tid intensiteten av en fluorescerende merket actomyosin ring protein slik som type II-myosin lettkjede-regulerende Rlc1. Her beskriver vi en mikroskopisk tilnærming til å analysere ulike stadier av cytokinese over tid.

Protocol

1. Fremstilling av prøve Grow fisjonsgjærceller uttrykker spindel pol kropp markør Sad1-mCherry 23 og type II myosin regulatoriske lett kjede Rlc1-Tomato 24 i YE væske ved 32 ° C i 8 generasjoner. MERK: For temperaturfølsomme mutanter, vokser cellene ved 25 ° C. Grow celler til midt-log fase til en OD 600 på 0,5 i YE. For mer om fisjon gjær vekstvilkår refererer til Fisjon gjær lab manual 25. Forbere…

Representative Results

Fisjon gjærceller uttrykker ring markør, ble Rlc1-GFP (grønt, figur 2) og spindel pol kropp markør Sad1-mCherry (rød, figur 2) fotografert under cytokinese. Utbruddet av spindelpolen legeme markør (hvit pil, figur 2A, B) er regnet som tiden 0. Rlc1-GFP signal vises på tidspunktet -4 min med henvisning til spindel pol legeme separasjon (rød pil, figur 2A, 2B). Rlc1-GFP signal danner en sammenhengende ring 10 min post spindel pol k…

Discussion

Her har vi beskrevet en protokoll for å studere cytokinetic hendelser i fisjon gjær i en tidsmessig måte. Protokollen er beskrevet her gir tidsoppløsning av forskjellige cytokinetic hendelser med henvisning til hverandre; Tidspunktet for protein rekruttering eller tap under henvisning til cytokinetic fase; struktur av ringen gjennom ulike faser av cytokinese; og progresjon av cytokinese med henvisning til mitose. Med denne protokollen er det mulig å presisere cytokinetic fase som kan bli endret på ulike mutanter, …

Materials

Yeast extract media	Sunrise Science Products	YES 225	0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine
Agarose	SeaKem LE agarose, Lonza	50001
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Glass Bottomed culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.
VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system	Visitech International, UK		with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).
ImageJ	NIH		Image analysis software