Análisis espacio-temporal de cytokinetic Eventos en la levadura de fisión

Summary

La levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe es un excelente sistema modelo para estudiar la citocinesis, la etapa final en la división celular. Aquí se describe un método de microscopía para analizar diferentes eventos cytokinetic en células de levadura de fisión en vivo.

Abstract

La citocinesis, el paso final en la división celular es fundamental para mantener la integridad del genoma. citocinesis adecuada es importante para la diferenciación celular y el desarrollo. Citocinesis implica una serie de eventos que están bien coordinados en el tiempo y el espacio. La citocinesis implica la formación de un anillo de actomiosina en el sitio de división, seguido por la constricción de anillo, la formación de la membrana y surco adicional remodelación de la matriz celular. La levadura de fisión, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) es un sistema modelo bien estudiado que ha puesto de manifiesto con claridad sustancial los acontecimientos iniciales en la citocinesis. Sin embargo, no entendemos claramente cómo los diferentes eventos cytokinetic son coordinadas espacio-temporalmente. Para determinar esto, hay que analizar los diferentes eventos cytokinetic en grandes detalles en el tiempo y en el espacio. Aquí se describe un método de microscopía para examinar diferentes ev cytokineticentos en células vivas. Con este enfoque es posible medir el tiempo de diferentes eventos cytokinetic y determinar el momento de la contratación de diferentes proteínas durante la citocinesis. Además, se describen protocolos para comparar la localización de proteínas, y la distribución en el sitio de la división celular. Este es un protocolo básico para estudiar la citocinesis en la levadura de fisión y también se puede utilizar para otras levaduras y sistemas de hongos.

Introduction

La citocinesis, el paso final en la división celular, es un proceso complejo esencial para la diferenciación correcta, el desarrollo y la supervivencia de un organismo. Citocinesis involucra múltiples eventos que se organizan para garantizar una correcta separación celular mientras se mantiene la integridad genómica ^1. La citocinesis implica eventos en los que un anillo de actomiosina una vez montado sufre constricción, que es concurrente con la expansión de la membrana y surcado, y remodelación de la matriz extracelular celular, finalmente seguido de abscisión de células ^{1, 2, 3.} Organización inadecuada de eventos cytokinetic puede dar lugar a defectos de separación celular y ploidía, y puede causar enfermedades como el cáncer ^{4, 5, 6, 7, 8.} Los principios fundamentales que permiten organización de eventos cytokinetic no se conocen bien, lo que conduce a bloqueos de carreteras en nuestra comprensión de la etiología de estas enfermedades.

La levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) es un excelente sistema modelo para estudiar la citocinesis debido a la naturaleza conservada de las proteínas implicadas ^1. En la levadura de fisión, después de actomiosina conjunto de anillo, el anillo entra en una fase de maduración / reposo donde no constreñir ^9. La maduración termina con el inicio de la constricción de anillo de actomiosina, concurrente con el ceño membrana y la ingresión tabique. Trabajo seminal en los últimos años nos han dado una comprensión bastante buena del conjunto de anillo de actomiosina en la levadura de fisión ^{1, 9, 10.} En algunos eucariotas, incluyendo la levadura de fisión, el ensamblaje de su anillo de actomiosina no es suficiente para surcado membrana. en fisión de levadura, la constricción del anillo por sí sola no proporciona suficiente fuerza para superar la presión de turgencia interna para la formación de surcos ^11. Un modelo reciente indica que esta fuerza se evita mediante la ingresión tabique ^11. En otro modelo, el papel de la extensión de la membrana de plasma se ha sugerido para contribuir a la formación de surcos ^{12, 13.} Constricción de anillo y surcado de membrana no se producen en la temperatura Bgs1 / CPS1 sensibles cps1-191 mutante, la principal enzima para la formación del tabique primario ^{14, 15.} Las células que carecen Bgs1 muestran tabique primario defectuoso y prolongada constricción de anillo ^{15, 16.} Bgs1 es reclutado para el sitio de la división celular de ingresión tabique durante la maduración después de actomiosina conjunto de anillo ^{17, 18.} SimilarlY, durante cellularization en embriones de Drosophila, la constricción de anillo es bifásica, con una tasa significativamente la constricción inicial lenta ^19, se asemeja a la fase de maduración observado en la levadura de fisión. Bifásica constricción anillo puede ralentizar surcado membrana para permitir la suficiente expansión de la membrana ²⁰ y la modificación de la matriz extracelular. Esto sugiere que después de actomiosina conjunto de anillo, se produce la constricción del anillo de manera eficiente sólo cuando la célula ha cumplido con los requisitos para la formación de surcos. No se entiende bien qué condiciones se requieren para la constricción de anillo de actomiosina después del montaje del anillo, ni los eventos moleculares que regulan este proceso. Recientemente hemos demostrado que, tras actomyosin anillo de montaje de la pequeña GTPasa Cdc42 se somete a un patrón de activación único espacio-temporal ^21. Este patrón es establecido por el patrón de localización única de los factores de intercambio de nucleótidos de guanidina Cdc42 (GEF) que activan Cdc42. El Gef1 GEF se localiza en el anillo de actomiosina montado y promueve la aparición de constricción de anillo y ingresión septum, mientras que Scd1 localiza en la membrana surcando y promueve la formación de septum normal. Nos encontramos con que el patrón de activación Cdc42 establecido por sus GEFs conducen a la regulación de los eventos cytokinetic distintas.

Para entender el mecanismo molecular de acontecimientos que finalmente conducen a la separación de células siguiente conjunto de anillo de actomiosina, hay que seguir los acontecimientos cytokinetic distintas en tiempo y espacio. En la levadura de fisión, la citocinesis implica primero el conjunto de nodos precursores alrededor del núcleo, lo que eventualmente reclutan la miosina tipo II, la formin Cdc12, y otras proteínas necesarias para el montaje del anillo de actomiosina. En cuando los eventos cytokinetic distintos y proporcionar un marco de referencia, la separación de los marcadores corporales polo del huso (formación de husillo) se considera como tiempo 0 ^22. El montaje de THanillo de actomiosina e puede ser seguido mediante el seguimiento en el tiempo de la intensidad de una proteína de actomiosina anillo marcado con fluorescencia tal como el II miosina de cadena ligera reguladora tipo RLC1. Aquí se describe un enfoque microscópico para analizar las diferentes etapas de la citocinesis en el tiempo.

Protocol

1. Preparación de la muestra Se cultivan las células de levadura de fisión que expresan el marcador polo del huso cuerpo SAD1-23 y II mCherry miosina de cadena ligera reguladora de tipo RLC1-24 Tomate en medios líquidos YE a 32 ° C durante 8 generaciones. NOTA: Para los mutantes sensibles a la temperatura, crecer las células a 25 ° C. Se cultivan las células a mediados de la fase de registro a un OD 600 de 0,5 en YE. Para más informaci…

Representative Results

Células de levadura de fisión que expresan el marcador anillo, RLC1-GFP (verde, Figura 2) y el husillo marcador de polo órgano SAD1-mCherry (rojo, Figura 2) se obtuvieron imágenes durante la citocinesis. El inicio de marcador cuerpo polo del huso (flecha blanca, las Figuras 2A, B) se considera como el tiempo 0. señal RLC1-GFP aparece en el momento -4 min con referencia al husillo separación cuerpo polo (flecha roja, las Figuras 2A,…

Discussion

Aquí hemos descrito un protocolo para estudiar eventos cytokinetic en la levadura de fisión de manera temporal. El protocolo descrito aquí proporciona una resolución temporal de diferentes eventos cytokinetic con referencia a la otra; momento de la contratación o la pérdida de proteínas con referencia a la fase cytokinetic; estructura del anillo a lo largo de las diferentes fases de la citocinesis; y la progresión de la citocinesis con referencia a la mitosis. Con este protocolo, es posible definir con precisió…

Materials

Yeast extract media	Sunrise Science Products	YES 225	0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine
Agarose	SeaKem LE agarose, Lonza	50001
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544
Glass Bottomed culture dish	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used.
VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system	Visitech International, UK		with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu).
ImageJ	NIH		Image analysis software