Spatiotemporele analyse van Cytokinetic Evenementen in Fission Yeast
Summary
De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe is een uitstekend modelsysteem om cytokinese te studeren, het laatste stadium van de celdeling. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic gebeurtenissen in levende splijtingsproducten gistcellen te analyseren.
Abstract
Cytokinese, de laatste stap in celdeling is essentieel voor het handhaven van de integriteit van het genoom. Juiste cytokinese is belangrijk voor celdifferentiatie en ontwikkeling. Cytokinese gaat om een reeks van gebeurtenissen die goed gecoördineerd worden in tijd en ruimte. Cytokinese omvat de vorming van een actomyosine ring aan de verdeling site, gevolgd door ring vernauwing, membraanvorming groef en extracellulaire matrix remodeling. De kernsplijting gist, Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) is een goed bestudeerde modelsysteem dat heeft onthuld met aanzienlijke duidelijkheid de eerste gebeurtenissen in cytokinese. Toch begrijpen we niet duidelijk hoe de verschillende cytokinetic gebeurtenissen spatiotemporeel worden gecoördineerd. Om dit te bepalen, moet men de verschillende cytokinetic gebeurtenissen in grote details analyseren zowel in tijd als in de ruimte. Hier beschrijven we een microscopie benadering van verschillende cytokinetic ev onderzoekenenten in levende cellen. Met deze aanpak is het mogelijk om keer anders cytokinetic evenementen en bepaalt het tijdstip van de aanwerving van verschillende eiwitten tijdens de cytokinese. Daarnaast beschrijven we protocollen eiwit lokalisatie en verdeling vergelijkt op de plaats van celdeling. Dit is een basisprotocol cytokinese bestuderen splijtgist en kan ook worden gebruikt voor andere gisten en schimmels systemen.
Introduction
Cytokinese, de laatste stap in celdeling, is een complex proces essentieel voor een goede differentiatie, ontwikkeling en overleving van een organisme. Cytokinese bestaat uit meerdere evenementen die worden georganiseerd om een succesvolle cel scheiding te verzekeren met behoud van genomische integriteit 1. Cytokinese impliceert evenementen waar een actomyosine ring eenmaal gemonteerd ondergaat vernauwing, dat is gelijk aan membraan uitbreiding en fronste, en extracellulaire matrix cellulaire remodeling, uiteindelijk gevolgd door de cel afsnijding 1, 2, 3. Onjuiste ordening cytokinetic gebeurtenissen kunnen leiden tot celscheiding en ploïdie gebreken, en kunnen ziekten zoals kanker 4, 5, 6, 7, 8 veroorzaken. De fundamentele principes die het mogelijk maken organisatie van cytokinetic gebeurtenissen zijn niet goed begrepen, hetgeen leidt tot wegversperringen in ons begrip van het ontstaan van deze ziekten.
De splijtgist Schizosaccharomyces pombe (S. pombe) is een uitstekend modelsysteem cytokinese onderzoeken vanwege de geconserveerde aard van de 1 eiwitten. In kernsplijting gist, na actomyosine ring montage, komt in de ring een rijping / dwell fase waarin het niet vernauwen 9. Rijping eindigt met de start van actomyosine ring vernauwing, tegelijk met membraan fronste en septum binnentreden. Baanbrekende werk door de jaren heen hebben we een redelijk goed begrip van actomyosine ring assemblage in kernsplijting gist 1, 9, 10 gegeven. In sommige eukaryoten, met inbegrip van kernsplijting gist, succesvolle montage van de actomyosine ring is niet voldoende voor membraan fronste. in fissie gist, ring vernauwing alleen niet voldoende kracht om interne turgordruk voor vore formatie 11 te overwinnen. Een recent model geeft aan dat deze kracht wordt geleverd door plaats septum 11 binnentreden. In een ander model is de rol van plasmamembraan verlenging voorgesteld bij te dragen aan de vorming 12, 13 doorkruisen. Ring beklemming en membraan fronste niet voorkomen in Bgs1 / CPS1 temperatuurgevoelige mutant cps1-191, de belangrijkste enzym voor de primaire septum formatie 14, 15. Cellen die Bgs1 tonen defecte primaire septum en langdurige ring vernauwing 15, 16. Bgs1 wordt aangeworven om de celdeling site voor septum binnentreden tijdens de rijping na actomyosine ring montage 17, 18. Similarly, tijdens cellularization in Drosophila embryo's, ring vernauwing is bifasisch met een significant trage initiële vernauwing tarief 19, die lijkt op de rijpingsfase waargenomen in kernsplijting gist. Tweefasige ring vernauwing kan vertragen membraan fronste om voldoende expansie membraan 20 en modificatie van extracellulaire matrix. Dit suggereert dat na actomyosine ring montage ring vernauwing optreedt efficiënt alleen wanneer de cel de vereisten voor vore formatie heeft voldaan. Het is niet goed begrepen welke voorwaarden zijn voldaan actomyosine ring vernauwing na ringsamenstel, noch de moleculaire gebeurtenissen die dit proces reguleren. We hebben onlangs aangetoond dat volgende actomyosine ring montage de kleine GTPase Cdc42 ondergaat een unieke tijdruimtelijk activering patroon 21. Dit patroon wordt vastgesteld door de unieke lokalisatie patroon van de Cdc42 guanidine nucleotide uitwisseling factoren (GEFs) die Cdc42 activeren. De GEF Gef1 lokaliseert aan de verzamelde actomyosine ring en bevordert het ontstaan van de ring beklemming en septum binnentreden, terwijl SCD1 lokaliseert de doorkruisen membraan en bevordert een normale septum formatie. We vinden dat de door haar GEFs Cdc42 activering patroon leiden tot de regulering van verschillende cytokinetic evenementen.
Om het moleculaire mechanisme van de gebeurtenissen die uiteindelijk leiden tot het scheiden van cellen volgende actomyosine ring assemblage te begrijpen, moet men de verschillende cytokinetic gebeurtenissen in tijd en ruimte te volgen. In kernsplijting gist, cytokinese gaat eerst de montage van voorloper knooppunten rond de kern, die uiteindelijk het type II myosine, de formin Cdc12, en andere eiwitten die nodig zijn voor actomyosine ring montage te werven. Tot tijd verschillende cytokinetic gebeurtenissen en een referentiekader, het scheiden van de spil paallichaam markers (spindle vorming) wordt als tijd 0 22. De montage van the actomyosine ring kan worden gevolgd door het monitoren van de tijd van de intensiteit van een fluorescent gelabeld actomyosine ring eiwit zoals het type II myosine regulerende lichte keten Rlc1. Hier beschrijven we een microscopische benadering verschillende stadia van cytokinese tijd geanalyseerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we een protocol beschreven cytokinetic gebeurtenissen in kernsplijting gist studeren in een tijdelijke manier. De hier beschreven protocol biedt tijdsresolutie van verschillende cytokinetic gebeurtenissen met betrekking tot elkaar; timing van eiwit aanwerving of het verlies met betrekking tot cytokinetic fase; structuur van de ring in de verschillende fasen van cytokinese; en de progressie van cytokinese hand van mitose. Met dit protocol is het mogelijk de cytokinetic fase die kan veranderen bij verschillend…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by startup funds from The University of Tennessee and TN-SCORE, a multi-disciplinary research program sponsored by NSF-EPSCoR (EPS-1004083).
Materials
| Yeast extract media | Sunrise Science Products | YES 225 | 0.5% w/v yeast extract, 3% w/v glucose, 225mg/L adenine, histidine, leucine, uracil, and lysine |
| Agarose | SeaKem LE agarose, Lonza | 50001 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | |
| Glass Bottomed culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | Coverslip No. 1.5 was used. This will vary as per the microscope specifications used. |
| VT-Hawk 2D array laser scanning confocal microscopy system | Visitech International, UK | with an Olympus IX-83 inverted microscope with a 100X / numerical aperture 1.49 UAPO lens (Olympus) and EM-CCD digital camera (Hamamatsu). | |
| ImageJ | NIH | Image analysis software |
References
- Pollard, T. D. Mechanics of cytokinesis in eukaryotes. Curr Opin Cell Biol. 22 (1), 50-56 (2010).
- Guertin, D. A., Trautmann, S., McCollum, D. Cytokinesis in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev. 66 (2), 155-178 (2002).
- Xu, X., Vogel, B. E. A secreted protein promotes cleavage furrow maturation during cytokinesis. Curr Biol. 21 (2), 114-119 (2011).
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584 (12), 2652-2661 (2010).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437 (7061), 1043-1047 (2005).
- Li, R. Cytokinesis in development and disease: variations on a common theme. Cell Mol Life Sci. 64 (23), 3044-3058 (2007).
- Daniels, M. J., Wang, Y., Lee, M., Venkitaraman, A. R. Abnormal cytokinesis in cells deficient in the breast cancer susceptibility protein BRCA2. Science. 306 (5697), 876-879 (2004).
- Storchova, Z., Pellman, D. From polyploidy to aneuploidy, genome instability and cancer. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (1), 45-54 (2004).
- Lee, I. J., Coffman, V. C., Wu, J. Q. Contractile-ring assembly in fission yeast cytokinesis: Recent advances and new perspectives. Cytoskeleton (Hoboken). 69 (10), 751-763 (2012).
- Balasubramanian, M. K., Bi, E., Glotzer, M. Comparative analysis of cytokinesis in budding yeast, fission yeast and animal cells. Curr Biol. 14 (18), R806-R818 (2004).
- Proctor, S. A., Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. Contributions of turgor pressure, the contractile ring, and septum assembly to forces in cytokinesis in fission yeast. Curr Biol. 22 (17), 1601-1608 (2012).
- Munoz, J., et al. Extracellular cell wall beta(1,3)glucan is required to couple septation to actomyosin ring contraction. J Cell Biol. 203 (2), 265-282 (2013).
- Wang, N., Lee, I. J., Rask, G., Wu, J. Q. Roles of the TRAPP-II Complex and the Exocyst in Membrane Deposition during Fission Yeast Cytokinesis. PLoS Biol. 14 (4), e1002437 (2016).
- Liu, J., Wang, H., McCollum, D., Balasubramanian, M. K. Drc1p/Cps1p, a 1,3-beta-glucan synthase subunit, is essential for division septum assembly in Schizosaccharomyces pombe. Génétique. 153 (3), 1193-1203 (1999).
- Cortes, J. C., et al. The (1,3)beta-D-glucan synthase subunit Bgs1p is responsible for the fission yeast primary septum formation. Mol Microbiol. 65 (1), 201-217 (2007).
- Cortes, J. C., et al. Cooperation between Paxillin-like Protein Pxl1 and Glucan Synthase Bgs1 Is Essential for Actomyosin Ring Stability and Septum Formation in Fission Yeast. PLoS Genet. 11 (7), e1005358 (2015).
- Cortes, J. C., Ishiguro, J., Duran, A., Ribas, J. C. Localization of the (1,3)beta-D-glucan synthase catalytic subunit homologue Bgs1p/Cps1p from fission yeast suggests that it is involved in septation, polarized growth, mating, spore wall formation and spore germination. J Cell Sci. 115 (Pt 21), 4081-4096 (2002).
- Liu, J., Tang, X., Wang, H., Oliferenko, S., Balasubramanian, M. K. The localization of the integral membrane protein Cps1p to the cell division site is dependent on the actomyosin ring and the septation-inducing network in Schizosaccharomyces pombe. Mol Biol Cell. 13 (3), 989-1000 (2002).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15 (2), 838-850 (2004).
- Figard, L., Xu, H., Garcia, H. G., Golding, I., Sokac, A. M. The plasma membrane flattens out to fuel cell-surface growth during Drosophila cellularization. Dev Cell. 27 (6), 648-655 (2013).
- Wei, B., et al. Unique Spatiotemporal Activation Pattern of Cdc42 by Gef1 and Scd1 Promotes Different Events during Cytokinesis. Mol Biol Cell. , (2016).
- Nabeshima, K., et al. Dynamics of centromeres during metaphase-anaphase transition in fission yeast: Dis1 is implicated in force balance in metaphase bipolar spindle. Mol Biol Cell. 9 (11), 3211-3225 (1998).
- Johnson, A. E., Gould, K. L. Dma1 ubiquitinates the SIN scaffold, Sid4, to impede the mitotic localization of Plo1 kinase. EMBO J. 30 (2), 341-354 (2011).
- Yonetani, A., Chang, F. Regulation of cytokinesis by the formin cdc12p. Curr Biol. 20 (6), 561-566 (2010).
- . . Fission Yeast: A laboratory Manual. , (2016).
- Hachet, O., Simanis, V. Mid1p/anillin and the septation initiation network orchestrate contractile ring assembly for cytokinesis. Genes Dev. 22 (22), 3205-3216 (2008).
- Zhou, Z., et al. The contractile ring coordinates curvature-dependent septum assembly during fission yeast cytokinesis. Mol Biol Cell. 26 (1), 78-90 (2015).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Huang, Y. S., Karashima, T., Yamamoto, M., Hamaguchi, H. O. Molecular-level investigation of the structure, transformation, and bioactivity of single living fission yeast cells by time- and space-resolved Raman spectroscopy. Biochimie. 44 (30), 10009-10019 (2005).
- Huang, C. K., Ando, M., Hamaguchi, H. O., Shigeto, S. Disentangling dynamic changes of multiple cellular components during the yeast cell cycle by in vivo multivariate Raman imaging. Anal Chem. 84 (13), 5661-5668 (2012).
- Le Goff, X., Woollard, A., Simanis, V. Analysis of the cps1 gene provides evidence for a septation checkpoint in Schizosaccharomyces pombe. Mol Gen Genet. 262 (1), 163-172 (1999).
