Denne protokollen beskriver intravital avbilding av transgene mus uttrykke celle-spesifikke fluorescerende markører. Intravital imaging inneholder en ikke-invasiv metode for høyoppløselig observasjoner i levende dyr bruker implanterbare windows som den mikroskopiske visualiseringen av prosesser er mulig. Denne metoden er spesielt nyttig å studere langsgående prosesser.
Svulst og svulst fartøyet utvikling, samt tumor respons på therapeutics, er svært dynamisk biologiske prosesser. Histologi gir statisk informasjon og er ofte ikke tilstrekkelig for en korrekt tolkning. Intravital evaluering, som en prosess er fulgt i tid, gir ekstra og ofte uventet. Med etableringen av transgene dyr uttrykke celle-spesifikke indikatorer og levende celle tracers forbedringer bildebehandlingsutstyr og utviklingen av flere tenkelig kamre, har intravital mikroskopi blitt et viktig verktøy for bedre å forstå biologiske prosesser. Dette dokumentet beskriver en eksperimentell design for etterforskningen av svulst fartøyet utvikling og terapeutiske effekter på en romlig og tidsmessige måte. Bruker dette oppsettet, kan scenen av fartøyet utvikling, tips cellen og lumen formasjon, blodstrøm, bloduttredelse, en etablert vaskulær seng og vaskulær ødeleggelse visualisere og fulgte. Videre kan terapeutiske effekter, intratumoral skjebne og lokalisering av chemotherapeutic forbindelser også følges.
Mens i vitro studier aktivere høyoppløselig kinetic avbildning av prosesser, aktiveres ikke i vitro eksperimentering evaluering i riktig sammenheng. For eksempel kan samspillet av kreftceller med stromal avdelinger eller narkotika-leveranser og distribusjon i en svulst studeres i en kultur plate. Dyremodeller brukes derfor å etterligne menneskelige fysiologi og patologi. Men er langsgående avbilding av prosesser, spesielt på en subcellular oppløsning, utfordrende. Molekylær imaging metoder, for eksempel magnetisk resonans imaging (MRI), enkelt-fotonet utslipp beregnet tomografi (SPECT) og fantes et positron utslipp tomografi (PET), har god gjennomtrenging dyp men mangel oppløsningen eller unnlater å illustrere anatomiske strukturer. Optisk tenkelig gir høy oppløsning og gjør avbilding av strukturer, men det er ledsaget av fattige minimal penetrasjon1. Programmet av intravital mikroskopi i kombinasjon med vinduet kammer teknologi, for eksempel en dorsal skinfold eller mage-vinduet gir høy-resolution tenkelig i vivo2,3,4. Denne teknologien har forskjellige fordeler, fordi det gir langsgående imaging timer og dager, for avbildning av prosesser i riktig sammenheng (f.eks celle-celle interaksjoner i fotografert vev), og løsninger på optisk grensene for avanserte AC confocal og multiphoton mikroskop.
Innføring av transgene dyr med celle – eller protein-spesifikk fluorescerende etiketter åpner en mengde muligheter for i vivo og ex vivo experimentations. For eksempel, celle-celle interaksjoner, produksjonen av proteiner og svaret manipulasjon eller terapi kan studeres modeller i vivo bruker disse5,6,7,8. Viktigere, plasser i sted og tid kan bestemmes med riktig bildebehandlingsutstyr og metodikk. Her, den intravital mikroskopi dyr uttrykke en endothelial markør i kombinasjon med injiserbare agenter i en svulst implantert i en modifisert dorsal skinfold vinduet kammeret er presentert.
Som svulst og svulst fartøyet utvikling, samt svulst terapeutiske effekter, er svært dynamisk prosesser, er intravital bedømmelse en elegant verktøy for å lage en riktig vurdering av prosessene på en gang – og romlig-avhengige måte. Med den økende tilgjengeligheten av levende celle markører, etableringen av transgene dyr og fremme av imaging modaliteter, blir intravital imaging mer og mer populært. Selv om histology brukes fortsatt rutinemessig, og en rekke indikatorer kan brukes til å identifisere celler og strukturer, har vev snitting ulemper når undersøke dynamisk prosesser. Vev disseksjon er nødvendig, bare statisk informasjon; fiksering påvirker vev kvalitet; og slicing skader mobilnettet interaksjoner. Også når undersøke dynamisk prosesser, krever vev disseksjon på forskjellige og ofte antatt, tidspunkt en stor mengde av dyr. Med intravital bildebehandling, kan XYZ romlige dimensjoner og den ekstra dimensjonen tid evalueres i samme dyret, gjør riktig posisjonering av mulig i rom og tid. Derfor optimal tidspunkt er ikke savnet, og dyr nummeret brukes per eksperimentet er betydelig redusert. Andre kan tid-vinduet etablert med intravital evaluering ekstrapolert for å optimalisere vev utvinning. Tredje kan ønsket scenen av fartøyet vekst identifiseres intravitally og flekker som en hel-mount vev.
Intravital design nevnt i dette manuskriptet bruker en kombinasjon av transgene dyr uttrykke en fluorescerende etikett i endotelceller, en modifisert dorsal skinfold kammeret modell og et dedikert multiphoton AC confocal mikroskop.
Endotelceller gå gjennom en rekke etapper21,22 under angiogenese, og disse stadiene kan ofte sees samtidig i en svulst. Ved hjelp av eNOSTag-GFP mus linjen, personlige endotelceller kan følges, og selv filopodia dynamics kan spores. Det er derfor en god modell å studere fartøyet utvikling intravitally. Avhengig av de allerede-DD iboende etikettene, kan injiserbare fluorescerende agenter brukes til å vurdere lumen formasjon, blodstrøm, bloduttredelse og blod klaring. Musen er fotografert kontinuerlig for opptil 5 h. Langsiktig evalueringen av et dyr er mulig når tatt flere forholdsregler angående anestesi av dyret, som har vært beskrevet tidligere23. Som denne forskningen er fokusert på kreft, ble svulster vev eller celler implantert. Men eksperimenterte vi også med metatarsals og embryonale lunger. Men er veksten av vev under studien begrensende, som etter et par uker, huden begynner å regrow, som kan være et problem med langsom voksende svulster eller vev.
I fasen for validering av dorsal skinfold vinduet kammeret ble betydelig endret i forhold til klassisk modell4. Rammene er konstruert av autoclavable syntetisk materiale og lys og liten, med stort vindu-visning-område. Kroken låseringen (figur 1Bg, hvitt pilhode) brukes bare for enkel fjerning av ringen. Retainer ringer uten kroker kan brukes når dette forstyrre bildebehandling. Huden strekkes ikke for mye, løsne forekommer ikke i denne modellen, og infeksjoner er bare sjelden sett. Disse endringene reduserer dyr ubehag og avgrense dyr prosedyren betydelig. Også kan metalldeler enkelt fjernes når imaging svulsten bruke MRI24.
Noen mikroskop kan bli vedtatt intravitally bildet dorsal skinfold kamre. Hovedkravet er tilgjengelig plass mellom mikroskop scenen og i linsen. Et viktig aspekt som påvirker imaging er bevegelse. For å hindre bevegelse, skal en plattform som passer i tabellen mikroskopet (etter fjerning av alle innsatser) og støtter musen brukes. Det er ikke nødvendig å holde musen når det er under anestesi, og det er bedre å la musen pusten fritt. Men i vinduet er boltet på plattformen, gir optimal fiksering av synsfelt (dvs. svulsten er synlig gjennom vinduet kammeret). Plattformen er oppvarmet ved hjelp av en elektronisk oppvarming pad, som brukes til dyr oppvarming. Denne plattformen ble gjort internt, og informasjon kan fås på forespørsel. En høy oppløsning linsen er en nødvendighet når du vurderer intracellulær prosesser og gjør det mulig å forskjellsbehandle cytoplasma og kjernen. Bruk av en konisk linse med en god optisk oppløsning (høy NA) men relativt lang arbeidsavstand (fortrinnsvis 2 mm eller nyere) anbefales. Begrensning i imaging er gjennomtrenging dyp og fluorescerende intensiteten av etikettene. Videre må photobleaching, Phototoksisitet og metning unngås under bildebehandling.
Her, ble en integrert AC confocal-multiphoton og AC confocal mikroskop brukt. Multiphoton er oppreist, mens den AC-confocal er en invertert mikroskop. Fordelen med en oppreist mikroskopet er lett bruk av vann nedsenking linser. Disse linsene har en høy NA og en lang arbeidsavstand, selv på en høy (f.eks 20 eller 40 X) forstørrelse. Spesielt anbefales å få en 20 X NA 1.0 vann nedsenking linse, som selges av flere selskaper. Vær oppmerksom at når nedsenking linser brukes, linsen og nedsenking væske må være oppvarmet til 37 ° C. For de beste bildene, anbefales det å bruke optimale AC confocal innstillinger (dvs. pinhole på 1 luftige enhet, laser makt så lavt som mulig gevinst ikke for høyt (spesielt hvis gevinsten introduserer støy), linjehastighet maksimum, og ingen snitt skanninger). Overeksponering, metning og forskjellen i intensiteter bilder kompromiss datakvaliteten. Det anbefales å hindre metning og overeksponering. Dette kan omgås ved å kjøpe bilder på forskjellige gevinst innstillinger. Endre gevinsten er den enkleste måten å endre bildet lysstyrken. Hvis nødvendig, kan laser makt justeres. For å standardisere bildekvaliteten, kan lysbilder med en fast fluorescens intensitet brukes. Man må huske på at selv når mikroskopet er optimalt, bestemmes bildekvalitet i stor grad av kvaliteten på vinduet kammer og vev
Når skanning flere fluorescerende markører samtidig, må gjennomslag, der en fluorophore registreres i kanalen i en annen, unngås. Unngå gjennomslag ved hjelp av en kombinasjon av fluorophores med minimal overlappende spectra og sekvensiell skanning mellom rammer. Bildene presentert her ble skannet med 3 sekvensielle avsøkinger (spor 1: GFP, DID eller fluor647 med 488 og 633 laser; spore 2: rhodamine, Doxil eller mTomato med 543 laser, og spore 3: Hoechst med 405 laser).
Muligheten til å vurdere flere stadier av svulst fartøyet utvikling, tips-cellen dynamics, lumen formasjon, bloduttredelse og vaskulære skader er vist her. Ved hjelp av eNOStag-GFP-linjen, er svulst områder med en ødelagt vaskulær seng lett oppdaget av granulert mobilnettet matrester likevel uttrykker GFP. Ingen injiserbare agent ble oppdaget i disse områdene viser mangel på flyt. Dette betyr at administrert chemotherapeutic agenter vil ikke nå disse områdene heller. Imidlertid kan fartøyet ødeleggelse også være et terapeutisk resultat. Før evaluering av svulsten, etter forbehandling fartøyet ødeleggelse, er en forutsetning for nøyaktig terapeutiske evalueringen og kan utføres enkelt med denne eksperimentell design.
Det er en overflod av muligheter som intravital mikroskopi kan brukes, og detaljert diskusjon er utenfor omfanget av denne publikasjonen. Gi en kort innsikt, inkluderer mulig programmer studier på akkumulering av chemotherapeutics i tumor vev, utviklingen av fartøy (f.eks antall fartøy, grener og kryss) og blodstrøm, celle-celle interaksjoner, celle målretting og intracellulær behandling, samt eksempler ovenfor og vist her. Som analysen er basert på fluorescens, være klar over intensitet svingninger på grunn av kvaliteten på vinduet eller vev. Også, som tumor vev er relativt tykk, fluorescens fra over eller under flyet av har en innvirkning på signalet i bildet. Det er best å kombinere kvantitative bildeanalyser med objektive mål. For eksempel, hvis interessert i stoffet konsentrasjoner, fjerne tumor vev fra vinduet etter intravital mikroskopi og finne stoffet innhold med HPLC sammenlignes med AC confocal bilder.
Evalueringen av tumor respons kan utføres som godt med denne modellen, men med forholdsregler. En må innse at svulster også vokser innover inn i huden. 3D-målinger gjøres hvis gjennomtrengning er dypt nok til å dekke hele svulsten. I slike tilfeller bør langt rødt fargestoffer brukes. Vinduet kammeret som beskrevet her avtaler med svulster i huden omgivelser, og det er viktig å påpeke at vinduet opprettholder en temperatur litt lavere enn normal mus kroppstemperaturen. Derfor er det best å studere tumorer i høyre mikro miljømessige innstillingen å bekrefte intravital studier med det dorsal skinfold vinduet kammer. Viktigere, den rygg skinfold kammeret gir innblikk i the kinetics av prosesser og mekanismer, gir en instrumental basis for forbedring av terapi. Ekstra informasjon om biodistribution og farmakokinetikken fås også. Klassisk, utføres disse biodistribution studier av behandler svulst-bærende dyr og dissekere svulster/organer for å måle narkotika opptak. Bruker denne intravital modellen, kan intratumoral plasseringen av et medikament (dvs. intravascular, intratumoral, intracellulær eller kjernefysiske) tilbys5,25,26. Ikke bare er plasseringen av stoffet avslørt, men også tid vindu-av-muligheten for mest optimale opptaket.
Bruker eksperimentell design beskrevet i denne artikkelen, kan en rekke parametere vurderes i timelige og romlig omgivelser. Spesielt viser her vi at intravital mikroskopi gir viktig innsikt i dynamikken i svulst fartøyet utvikling og terapeutiske respons.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Rien van Haperen og Rini de Crom for deres utvikling og donasjon av eNOSTag-GFP linje, Joost A.P. Rens for hans kundestøtte med dyr arbeidet og dyr vaktmester for deres hjelp. Mikroskopi fasilitetene brukes er en del av Erasmus optisk Imaging Center, og vi ønsker å takke ansatte på OIC for deres tjeneste. Denne studien ble støttet av grant DDHK 2000-2224 fra hollandske Kreftforeningen, “Vereniging Trustfonds” Erasmus University Rotterdam og “Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, og vi takker medlemmene av komiteene for deres generøse donasjonen.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |