Det här protokollet beskriver den intravital avbildning av transgena möss uttrycker-specifika fluorescerande markörer. Intravital imaging ger en icke-invasiv metod för högupplösta observationer i levande djur med implanterbara windows genom vilka mikroskopiska visualisering av är möjligt. Denna metod är särskilt användbar för att studera längsgående processer.
Tumör och fartyget tumörutveckling, samt tumör svar på therapeutics, är mycket dynamiska biologiska processer. Histologi ger statisk information och är ofta inte tillräckligt för en korrekt tolkning. Intravital utvärdering, där en process följs i tid, ger extra och ofta oväntad information. Med skapandet av transgena djur uttrycka-specifika markörer och levande cell spårämnen, förbättringar av bildåtergivningsutrustning och utvecklingen av flera imaging kammare, har intravital mikroskopi blivit ett viktigt verktyg för att bättre förstå biologiska processer. Detta dokument beskriver en experimentell design för utredning av fartyget tumörutveckling och terapeutiska effekter på ett rumsliga och tidsmässiga sätt. Med denna setup, kan scenen av fartyget utveckling, tip-cellen och lumen bildandet, blodflödet, extravasering, etablerade vaskulär säng och vaskulär förstörelse visualiseras och följt. Dessutom terapeutiska effekter, intratumoral öde, och lokalisering av kemoterapeutiska föreningar kan också följas.
Även om in vitro- studier aktivera högupplösta kinetiska avbildning av processer, aktiverar i vitro experiment inte utvärdering i rätt sammanhang. Exempelvis kan inte samspelet mellan tumörceller med stromaceller fack eller drogen leverans och distribution inuti en tumör studeras i en kultur plattan. Djurmodeller används därför för att efterlikna människans fysiologi och patologi. Men är den längsgående avbildning av processer, särskilt på en subcellulär upplösning, utmanande. Molekylär imaging metoder, såsom magnetisk resonanstomografi (MRT), single-photon utsläpp beräknas tomography (SPECT) och positronemissionstomografi (PET), har god penetration djup men saknar upplösning eller misslyckas att illustrera anatomiska strukturer. Optisk imaging ger hög upplösning och möjliggör bildtagning av strukturer, men det åtföljs av fattiga till minimal penetration1. Tillämpningen av intravital mikroskopi i kombination med fönster kammare tekniker, såsom en dorsal skinfold eller buken fönster, möjliggör högupplöst avbildning i vivo2,3,4. Denna teknik har distinkta fördelar, som gör det möjligt för längsgående imaging över timmar och även dagar, för avbildning av processer i rätt sammanhang (t.ex. cell-cell interaktioner i avbildad vävnaden) och för beslut vid optisk gränserna för avancerade confocal och multiphoton Mikroskop.
Införandet av transgena djur med cell – eller protein-specifika fluorescerande etiketter öppnar en uppsjö av möjligheter för i vivo och ex vivo experimenterande. För instans, cell-cell interaktioner, produktionen av proteiner och svaret på manipulation eller terapi kan studeras modeller i vivo med hjälp av dessa5,6,7,8. Ännu viktigare, position i tid och plats kan bestämmas med korrekt imaging utrustning och metodik. Här, intravital microscopyen djur uttrycker en endothelial markör i kombination med injicerbara medel i en tumör som implanteras i en modifierad dorsala skinfold fönster avdelningen presenteras.
Tumör och fartyget tumörutveckling, samt tumör terapeutiska effekter, är mycket dynamiska processer, är intravital utvärdering ett elegant verktyg för att göra en korrekt bedömning av dessa processer på ett sätt som tid – och rumsliga-beroende. Med den ökande tillgången till levande cell markörer, skapandet av transgena djur och befordran av imaging modaliteter, blir intravital imaging mer och mer populärt. Även om histologi används fortfarande rutinmässigt, och en mängd markörer kan användas för att identifiera celler och strukturer, har vävnad snittning nackdelar när du undersöker dynamiska processer. Vävnad dissektion krävs, ge endast statisk information; fixering påverkar vävnad kvalitet; och skivning skadar cellulära interaktioner. Också, när du undersöker dynamiska processer, vävnad dissektion på olika och ofta förmodade, tidpunkter kräver en stor mängd djur. Med intravital imaging, kan XYZ rumsliga dimensioner och den extra dimensionen tid utvärderas på samma djur, gör den korrekt placering av olika spelare möjligt i tid och rum. Därför optimala tidpunkter är inte missat, och antalet djur som används per experiment har minskat avsevärt. För det andra kan-fönstret tid etablerat med intravital utvärdering extrapoleras för att optimera vävnad extraktion. För det tredje, önskad långt fartyget tillväxt kan identifieras intravitally och målat som en helhet-mount vävnad.
Intravital designen nämns i detta manuskript använder en kombination av transgena djur uttrycker en fluorescerande etikett i endotelceller, en modifierad dorsala skinfold kammare modell och en dedikerad multiphoton-confocal mikroskopet.
Endotelceller gå igenom ett antal etapper21,22 under angiogenes, och dessa stadier kan ofta ses samtidigt i en tumör. Använder eNOSTag-GFP mus linjen, enskilda endotelceller kan följas, och även filopodia dynamics kan spåras. Det är därför en bra modell för att studera fartyget utveckling intravitally. Beroende på de redan-nu inneboende etiketterna, kan injicerbara fluorescerande agenter användas att bedöma lumen bildandet, blodflödet, extravasering och blod clearance. Musen är avbildade kontinuerligt i upp till 5 h. Långsiktig utvärdering av ett djur är genomförbart när flera försiktighetsåtgärder avseende bedövning av djuret tas, som har beskrivits tidigare23. Som denna forskning är fokuserad på cancer, var tumörer vävnad eller celler implanteras. Dock experimenterat vi också med fotbenen och embryonala lungor. Dock är tillväxttakten i vävnaden under studien begränsande, som efter ett par veckor, börjar huden att återföds ständigt, vilket kan vara ett problem med långsamt växande tumörer eller vävnader.
Under fasen för validering i dorsala skinfold fönster kammare ändrades avsevärt jämfört med klassisk modell4. Ramarna är tillverkade av autoklaverbart syntetiskt material och är lätta och små, med ett stort fönster-Visa område. Kroken för låsringen (figur 1Bg, vita pilspets) används endast för enkel borttagning av ringen. Hållare ringar utan krokar kan användas när dessa störa imaging. Huden sträcks inte för mycket, lossa uppstår inte i denna modell, och infektioner ses sällan. Dessa modifieringar minska animaliskt obehag och förfina djur förfarandet avsevärt. Också, metalldelarna kan lätt avlägsnas när imaging tumören med hjälp av MRI24.
Alla Mikroskop kan antas till intravitally bild dorsala skinfold chambers. Det viktigaste kravet är det tillgängliga utrymmet mellan Mikroskop scenen och objektivet. En viktig aspekt som påverkar imaging är motion. För att förhindra rörelse artefakter, ska en plattform som passar i tabellen Mikroskop (efter avlägsnande av alla skär) och stöder musen användas. Det är inte nödvändigt att hindra musen när det är under narkos, och det är bättre att låta musen andetag fritt. Men fönstret är bultad på plattformen, vilket ger optimal fixering av synfältet (dvs tumören är synliga genom fönstret kammaren). Plattformen är uppvärmd med en elektronisk värmedyna, som använde för djurens värme. Denna plattform var gjord in-house och detaljerna kan erhållas på begäran. En högupplöst objektiv är en nödvändighet när du utvärderar intracellulära processer och gör det möjligt att diskriminera mellan cytoplasman och kärnan. Användning av en avsmalnande lins med en bra optisk upplösning (hög NA) men en relativt långa arbetsavstånd (helst 2 mm eller högre) rekommenderas. Begränsningen i imaging är genomträngningsdjupet och fluorescerande intensiteten i etiketterna. Dessutom måste fotoblekning, fototoxicitet och mättnad undvikas under imaging.
Här, användes en integrerad confocal-multiphoton och en confocal mikroskopet. Multiphoton är upprätt, medan de confocal är en inverterade Mikroskop. Fördelen med ett upprätt Mikroskop är lätt användningen av nedsänkning i vatten linser. Dessa linser har en hög NA och en lång arbetsavstånd, även vid en hög (t.ex. 20 eller 40 X) förstoring. Specifikt, rekommenderas det att skaffa en 20 X NA 1.0 nedsänkning i vatten lins, som säljs av flera företag. Vara medveten om att när nedsänkning linser används, den objektiv och nedsänkning vätska behöver värmas till 37 ° C. För de bästa bilderna, det rekommenderas att använda optimala confocal inställningar (dvs hål på 1 luftiga enhet, laser power så låg som möjligt, vinst inte för högt (särskilt om vinsten introducerar buller), linjehastighet på maximum och ingen genomsnitt skanningar). Överexponering, mättnad och skillnaden i intensitet mellan bilderna äventyra datakvalitet. Det rekommenderas att förhindra mättnad och överexponering. Detta kan kringgås genom att förvärva bilder vid olika vinst inställningar. Ändra vinsten är det enklaste sättet att ändra bildens ljusstyrka. Om det behövs kan lasereffekten justeras. För att standardisera bildkvaliteten, kan bilder med en fast fluorescensintensitet användas. Man måste hålla i åtanke att även när mikroskopet ställs in optimalt, bildkvalitet bestäms i stor utsträckning kvaliteten på fönster plenisalen och vävnad
När du skannar flera fluorescerande markörer samtidigt, måste genomlysningseffekten, där en fluorophore detekteras i kanalen av en annan, undvikas. Undvika genomlysningseffekten genom att använda en kombination av fluorophores med minimal överlappande spectra och sekventiell skanning mellan ramar. De bilder som presenteras här har skannats med hjälp 3 sekventiell skanningar (spår 1: GFP, DID eller fluor647 med 488 och 633 laser; spår 2: rodamin, Doxil eller mTomato med 543 laser; och spår 3: Hoechst med 405 laser).
Här visas möjligheten att utvärdera flera skeden av fartyget tumörutveckling, tip cell dynamics, lumen bildandet, extravasering och kärlskador. Använder linjen eNOStag-GFP, upptäcks tumör områden med förstörda vaskulär säng lätt av granulerad cellulära rester fortfarande uttrycker GFP. Ingen injicerbara agent upptäcktes i dessa områden, som anger bristen på flödet. Detta innebär att administreras kemoterapeutika når inte dessa områden heller. Fartyg förstörelse kan dock också vara ett terapeutiskt resultat. Före utvärdering av tumören, att kontrollera för förbehandling fartyget förstörelse, är en förutsättning för korrekta terapeutiska utvärdering och kan utföras enkelt med denna experimentella design.
Det finns en uppsjö av möjligheter som intravital mikroskopi kan användas, och detaljerad diskussion är utanför ramen för denna publikation. För att ge en kort inblick, inkludera möjliga tillämpningar studier på ackumulation av kemoterapeutika i tumörvävnad, utveckling av fartyg (t.ex. antalet fartyg, grenar och korsningar) och blodflödet, cell-cell interaktioner, cell inriktning, och intracellulära bearbetning, samt exempel på ovan nämnda och visas här. Som analysen baseras på fluorescens, vara medveten om intensitet svängningar på grund av fönstret eller vävnad. Också, som tumörvävnad är relativt tjock, fluorescens från ovan eller under planet synpunkt inverkar på signalen i bilden. Det är bäst att kombinera den kvantitativ bildanalys med objektiva mätningar. Exempelvis om intresserad läkemedelskoncentrationen, ta bort tumörvävnad från fönstret efter intravital mikroskopi och bestämma drogen innehåll med med HPLC för att jämföra med de confocal bilderna.
Utvärdering av tumör svar kan utföras som väl med denna modell, men med vissa försiktighetsåtgärder. Man måste inse att tumörer också växa inåt, in i huden. 3D-mått kan göras om penetrationen är tillräckligt djup för att täcka hela tumören. I sådana fall bör mån färgämnen användas. Fönster kammaren som beskrivs här erbjudanden med tumörer i huden miljö, och det är viktigt att påpeka att fönstret håller en temperatur något lägre än kroppstemperaturen normal mus. Därför är det bäst att studera tumörer i inställningen för just micro miljö för att bekräfta intravital studier med den dorsala skinfold fönster kammare. Ännu viktigare, den dorsala skinfold kammare erbjuder inblick i kineticsen av processer och mekanismer, som ger en instrumental grund för förbättring av terapi. Dessutom kan extra information om biodistribution och farmakokinetik erhållas. Klassiskt, utförs dessa biodistribution studier av behandling av tumör-bärande djur och dissekera tumörer/organ för att mäta drog upptag. Använder denna intravital modell, kan intratumoral platsen för ett läkemedel (dvs intravaskulär, intratumoral, intracellulära eller kärnavfall) ges5,25,26. Är inte bara platsen för drogen avslöjade, men också tid fönster-av-möjlighet för mest optimala upptaget.
Med hjälp av experimentell design som beskrivs i denna artikel, kan ett brett utbud av parametrar utvärderas i en temporal och spatial inställning. Specifikt, visar här vi att intravital mikroskopi ger viktiga insikter i dynamiken i fartyget tumörutveckling och terapeutiskt svar.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Rien van Haperen och Rini de Crom för deras utveckling och donation av eNOSTag-GFP, Joost A.P. Rens för hans tekniskt bistånd med animaliskt arbete och djur vaktmästare för deras hjälp. De mikroskopi utrymmen som används är en del av stadens Erasmus optisk Imaging, och vi vill tacka Personalen på OIC för sin tjänst. Denna studie stöddes av grant DDHK 2000-2224 från holländska Cancerfonden, ”Vereniging Trustfonds” Erasmus University Rotterdam och ”Stichting Erasmus Heelkundig Kankeronderzoek”, och vi tackar ledamöterna i utskotten för deras generösa donation.
DMEM | Sigma | D1145 | Supplemented with 10% FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | Make a 0.1% solution in PBS, sterile |
PBS | |||
Window frames | Costum made | ||
Filler glass 10 mm, 0.55 mm | Abrisia technologies | ||
Cover glass 12mm, #1 thickness | Thermo Scientific/VWR | 631-0713 | |
Hear removal gel (veet) | for sensitive skin | ||
Eye ointment | |||
Buprenorfine hydrochloride | use 0.05 mg/kg | ||
Anesthesia unit | O2/Isoflurane inhalation unit with an chamber and tubeing+cone | ||
insulin syringe 0.5ml x 12.7mm 29g, green | BD | 324824 | |
Needles 23G 1 1/4" | Braun | 4657640 | |
Needles 25G 5/8" | Braun | 4657853 | |
Sutures silkan 0.7 | Braun | 1134019 | |
Nuts | Jeveka | 934 A2 1 | |
Bolts | Jeveka | 84 A2 1 10 | |
0.9% NaCl | |||
Microscope + software | The space between table and objective need to be wide enough to hold the animal | ||
Heated temperature controlled platform | Costum made | ||
Window holder | Costum made | ||
tetramethylrhodamine 2,000,000 MW dextran | Invitrogen | D7139 | 100 µg/mouse |
Alexa-fluor 647 10,000 MW dextran | Invitrogen | D22914 | 100 µg/mouse |
Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | 25 µg/mouse |
Pegulated nanoparticles | ref 5 | ||
LEICA TCS SP5 Multiphoton Microscope | Leica | ||
LAS AF Software | Leica |