Produksjon og Administrasjon av Therapeutic Mesenchymale Stem / stromal Cell (MSC) Spheroids Grunnet i 3-D kulturer Under Xeno-frie betingelser
Summary
The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
Abstract
Mesenchymale stamceller / stromale celler (MSC) holder store løftet i bioteknologi og regenerativ medisin. MSC kan isoleres fra flere voksent vev via deres sterke tilslutning til vevskultur plast og deretter ytterligere ekspandert in vitro, som oftest ved hjelp av bovint serum (FBS) føtalt. Siden FBS kan føre til MSC til å bli immunogen, dens tilstedeværelse i MSC kulturer begrenser både kliniske og eksperimentelle anvendelser av cellene. Derfor studier som anvender kjemisk definerte Xeno-free (XF) media for MSC kulturer er svært verdifull. Mange fordelaktige effekter av MSC har blitt tilskrevet deres evne til å regulere inflammasjon og immunitet, hovedsakelig gjennom sekresjon av immunmodulerende faktorer, slik som tumor-nekrose faktor-stimulert gen 6 (TSG6) og prostaglandin E2 (PGE2). Men MSC krever aktivering for å produsere disse faktorene og da effekten av MSC er ofte forbigående, har stor interesse dukket opp for å oppdage måter å pre-aktivere cellene PRIOr deres anvendelse, og dermed eliminere forsinkelsen for aktivering in vivo. Her presenterer vi protokoller for å effektivt aktivere eller prime MSC i tre-dimensjonale (3D) kulturer etter kjemisk definerte XF forhold og å administrere disse forhåndsaktivert MSC in vivo. Spesielt vi først beskrive metoder for å generere sfærisk MSC mikro vev eller 'kuler' i hengende dråper bruker XF medium og vise hvordan kulene og kondisjonert medium (CM) kan høstes for ulike bruksområder. Deretter beskriver vi genekspresjon skjermer og in vitro funksjonelle analyser for raskt å vurdere graden av MSC aktivering i sfæroider, med vekt på anti-inflammatorisk og anti-kreft potensial av cellene. For det tredje, beskriver vi en ny fremgangsmåte for å injisere intakte MSC sfæroider i musen bukhulen for in vivo-effektivitet testing. Totalt sett protokollene her vinne store utfordringer med å skaffe pre-aktivert MSC henhold kjemisk definert XF conforhold og tilveiebringe et fleksibelt system for å administrere MSC kuler for terapi.
Introduction
Mesenchymale stilk / stromale celler (MSC) har vist stort potensial for ulike regenerativ medisin tilnærminger. MSC ble opprinnelig isolert som en stromal komponent av benmarg, men har siden blitt erholdt fra mange andre voksne vev, blant annet fettvev 1, 2, 3. Interessant, omfatter hovedisoleringsmetoden den bemerkelsesverdige egenskap av MSC for å overholde fast på vevskultur plast i nærvær av føtalt bovint serum (FBS). Mens dette tradisjonelle isolasjon teknikken tillater enkel og rask utvidelse av MSC i to-dimensjonale (2D) kultur, er det også veldig kunstig og ser bort fra betydningen av de innfødte tredimensjonale (3D) miljø fører til potensielle tap av viktig cellular egenskaper 4, 5 6. Derfor studiet av MSC i 3D kulturer, noe somer mer fysiologisk enn tradisjonelle 2D kulturer, har dukket opp i søk etter "tapte / forminskede" MSC egenskaper. Videre har stor interesse steget å identifisere Xeno-free (XF) kjemisk definerte vilkår for MSC kultur og aktivisering, og dermed gjøre cellene mer mottagelig for kliniske applikasjoner.
Mange studier har blitt publisert som viser 3D-kulturen i MSC både i biomaterialer og som sfæriske aggregater eller kuler. MSC i biomaterialer ble opprinnelig utviklet for tissue engineering tilnærminger for å erstatte skadede vev med celle-seeded stillasene, mens sfæroide kulturer av MSC ble sett på som en måte å forstå MSC oppførsel in vivo etter administrering av cellene for behandling i prekliniske eller kliniske studier 4, 5, 7. Interessant, MSC skjema kuler spontant når tilslutning til vev kultur plast er ikke tillatt8, 9, 10. Tradisjonelt ble celle aggregering tilrettelagt av spinneren kolbe metoder eller flytende overlay teknikker, metoder som brukes i utgangspunktet i kreft biologi i arbeidet med å prøve å etterligne svulsten mikromiljøet. I den senere tid har flere metoder til overflaten som viser celle aggregering i kulturskåler på forhånd belagt med visse kjemikalier for å forhindre celle-til-plast adhesjon 4, 5, 6. En av de enkleste og mest økonomiske metoder for å generere MSC kuler er til kultur dem i hengende dråper, en teknikk som ofte ble brukt til å fremstille embryoid legemer fra embryonale stamceller. Med hengende dråpe kultur teknikk, er celle tilslutning til vevskultur plast forhindres ved å suspendere cellene i et dråpe medium på undersiden av en vevskulturskål lokk og tillater tyngdekraften for å lette celle aggregasjon i toppen av fallet. Den sfæroide størrelse kan lett manipuleres ved å endre cellekonsentrasjon eller rulle volum, noe som gjør hengende dråpe kulturer særlig enkle å kontrollere.
Tidlige studier på 3D-kultur av MSC viste radikale forskjeller i egenskapene til de celler i 3D i forhold til deres motparter 2D 6, 8, 9. På samme tid, rapporter vist at de gunstige virkninger av MSC in vivo avhengig av deres evne til å bli aktivert av mikro-miljø signaler og, som reaksjon, for å fremstille anti-inflammatoriske og immunmodulerende faktorer 11. Det er interessant at mange av disse faktorer slik som prostaglandin E2 (PGE2), tumor nekrose faktor-stimulert gen 6 (TSG6), og hepatocytt vekstfaktor (HGF) ble produsert i mye større mengder av MSC kuler enn tradisjonelle 2D MSCer banet vei for ideen omved bruk av 3D-kulturer for å aktivere cellene 8, 12, 13. Videre genaktivering i 3D-kulturer først å rekapitulere mekanismer, i det minste delvis, av celleaktivering etter injeksjon inn i mus 12. Ved å aktivere MSC før deres anvendelse i eksperimenter, kan virkningene av cellene være langvarig og mer fremtredende som de tradisjonelle MSC effekt in vivo, er ofte forsinket og forbigående, og kan beskrives som "hit og kjør". I løpet av de siste årene, har viktige funksjonelle studier ved bruk av MSC sfæroider vist at de kan undertrykke inflammatoriske responser og modulere immunitet in vivo ved å påvirke effektor celler slik som makrofager, dendrittiske celler, nøytrofiler og T-celler som gjør sfæroider en attraktiv form av primede MSCer 2 , 3. I tillegg er produksjonen av anti-kreft-molekyler, slik som interleukin-24 (IL-24) og tumor nekrose faktor-relatert apoptose-induserende ligand (TRAIL) er økt i 3D-kulturer av MSC i forhold til monolaget MSCer, et fenomen som kan utnyttes for målrettet cancerterapi 8, 10, 14.
Som den tradisjonelle MSC kulturen kreves ikke bare bruken av vevskultur plast, men også FBS, til et annet hinder gjøre MSC sfæroider mer mottagelig for klinisk bruk måtte overvinnes. For å takle dette hinderet, vi nylig viste dannelsen av MSC kuler under bestemte kjemisk definerte XF vilkår og etablerte at de resulterende MSC kuler ble aktivert for å produsere de samme anti-inflammatorisk og anti-kreft molekyler som kulene generert i forhold med FBS 14. Her er disse funnene presentert i flere detaljerte protokoller som viser generasjon pre-aktivert MSC i 3D kulturer som bruker XFmedia. I tillegg er protokoller presentert som beskriver effektive måter å vurdere aktiveringsnivåer i MSC i forhold til deres anti-inflammatoriske, immunmodulerende og anti-kreft effekt, sammen med en praktisk metode for å levere de intakte sfæroidene i mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den optimale MSC for bruk i noen forskning og kliniske applikasjoner bør være svært aktivert for å maksimere sin fordel, og fortrinnsvis utarbeidet under kjemisk definerte XF vilkår for å minimere levering av potensielle antigener fra xenogene mellom komponenter som FBS. I protokollen beskrevet her, har vi vist metoder til 1) aktivere MSC i 3D kultur ved dannelse av kuler, 2) oppnå 3D-aktivering av MSC henhold XF forhold, 3) vurdere aktiveringsnivå sfæroide MSC i forhold til deres anti- inflammatoriske, immunmo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
Materials
| MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
| FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
| L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
| Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
| 150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
| Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
| Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
| water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
| Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
| Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
| Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
| PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
| 0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
| 15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
| 50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
| Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
| trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
| Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
| Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
| HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
| rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
| 8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
| Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
| Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
| RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
| Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
| Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
| High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
| Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
| Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
| Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
| 1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
| (-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
| PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
| J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
| 12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
| LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
| Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
| RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
| BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
| Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
| 70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
| Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
| Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
| LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
| DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
| EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
| Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
| Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
| HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
| Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
| Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
| Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
| Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
| Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |
References
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
- Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
- Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
- Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
- Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
- Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
- Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells’ Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
- Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
- Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
- Krampera, M. Mesenchymal stromal cell ‘licensing’: a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
- Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?. Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
- Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).
