هيئة الثقافة والجامع جبل المناعي تلون ماوس وولف القنوات
Summary
ونحن نقدم وسيلة لعزل وثقافة قناة وولف الماوس (WD). نحن أيضا يبرهن على وجود إجراءات مفصلة لجبل بأكمله المناعية من WDS مثقف / المعزولة حديثا مع الأجسام المضادة الموسومة fluorescently. معا، وتمكن هذه التقنيات دراسة التطور WD، اللف، والتمايز.
Abstract
التشكل البوق هو شرط أساسي لتنمية معظم أجهزة الثدييات، بما في ذلك الجهاز التناسلي الذكري. البربخ، جزءا لا يتجزأ من الجهاز التناسلي الذكري، هو المسؤول عن تخزين الحيوانات المنوية، والنضج، والنقل. البربخ الكبار هو أنبوب ملفوف جدا أن يتطور من السلائف الجنينية بسيطة ومباشرة والمعروفة باسم قناة وولف (WD). اللف السليم من البربخ هو ضروري لخصوبة الرجال، كما الحيوانات المنوية في الخصية غير قادرين على تخصيب بويضة. ومع ذلك، فإن الآلية المسؤولة عن التنمية بربخي واللف لا تزال غير واضحة، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق الثقافة الجهاز والتصوير كله. في هذه الدراسة، ونحن تصف نظام الثقافة في المختبر، وكله بروتوكول المناعي جبل لتصور أفضل لعملية WD اللف والتنمية، والتي يمكن أيضا أن تطبق على دراسة أجهزة الأنبوبية الأخرى.
Introduction
الجهاز التناسلي الذكري يتكون أساسا من الخصية، موقع لتطوير الخلايا الجرثومية والتمايز، ونظام الأقنية معقدة ما هو مطلوب للنضوج، والنقل، وتخزين الحيوانات المنوية. البربخ هو الجهاز الأنبوبي الذي يصل الخصية مع الأسهر وتشارك بشكل رئيسي في تطوير ما بعد الخصية ونضوج الخلايا الجرثومية 1. البربخ الماوس الكبار ملفوف غاية تتطور من بسيطة ومباشرة أنبوب السلائف، قناة وولف (WD) 1. بنية معقدة وملفوف من البربخ هو ضروري للحيوانات المنوية لاكتساب القدرة على تخصيب خلايا الإناث الجرثومية 2. كيف هذا الجهاز ضروري لخصوبة الرجال يتطور ويحصل في شكل ليست مفهومة جيدا. وقد ثبت مختلف مسارات الإشارات إلى أن تشارك في تطوير WD مثل إشارات Wnt مسار 3،4 والاندروجين إشارات الطريق 5. وقد أنشأت عملنا مؤخرا شرط بالanced WNT يشير لWD اللف خلال تطوير ما قبل الولادة (4). ومع ذلك، هناك حاجة مزيد من الدراسات لفهم الآليات التي تشارك في اللف بعد الولادة بربخي، تمايز الخلايا، والاتصالات خلية إلى خلية داخل الظهارة بربخي ومع خلايا الخلالية.
وقد ثبت نماذج الماوس المعدلة وراثيا ليكون أداة قوية لتحديد / التحقق من الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور والمرض من أجهزة الجسم المختلفة 6. وعلى الرغم من الاستخدام الواسع النطاق، وهناك قيود كبيرة من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، بما في ذلك النمط الظاهري غير متوقع من المسوخ الماوس المستهدفة فيما يتعلق وظيفة الجين يفترض، وليس النمط الظاهري في المسوخ فارغة في بعض الموديلات، تأثير العوامل الوراثية والبيئية، والعمل المكثف و عملية تطوير نماذج الماوس تستغرق وقتا طويلا. ولذلك، فإن تفسير أهمية النتائج فقط من مودى وراثيانماذج الماوس fied ليست دائما واضحة 6. هذه القيود يمكن التغلب عليها باستخدام في نظام الثقافة الجهاز المختبر الذي يعطي لنا المرونة اللازمة لمعالجة مسارات إشارات متعددة في الوقت الحقيقي في ظروف الثقافة التي تسيطر عليها. نظام الثقافة الجهاز هو دور أساسي في فهم علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض من أجهزة كاملة 7. وعلاوة على ذلك، والتصوير الأجهزة كلها ملطخة الأجسام المضادة fluorophore المسمى تمكننا من تصور علامات الاهتمام في سياق ثلاثي الأبعاد، كما هو موجود في الجسم الحي، وبالتالي توفير فهم أفضل لشكل الجهاز، وهيكل، وظيفة 8.
هنا، التي وصفناها الطرق لعزل الماوس التلال الغدد التناسلية الجنينية، في المختبر الثقافة وجبل بأكمله المناعي التصوير WDS، التي يمكن تطبيقها للرد على مجموعة متنوعة من الأسئلة المتعلقة التشكل من أجهزة أنبوبي مثل WDS. في هذا البروتوكول، ونحنمعزولة الماوس الجنينية التلال البولي التناسلي من 15.5 يوم تال للجماع (DPC) السدود الحوامل ومثقف منهم لمدة 3 د تليها المناعية للعلامة الظهارية خلية (cytokeratin 8، CK8)، علامة تكاثر الخلايا (الفوسفات-هيستون 3، PH3) ونشطة βcatenin.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظام الثقافة الجهاز لديه العديد من المزايا على خلية نظام الثقافة التقليدية. هذا النظام يحتفظ العلاقات الهيكلية الأصلية والتفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا. أنه يحاكي في أنظمة الجسم الحي ويعطي معلومات أكثر دقة من دراسات ثقافة الخلية حيث العامل المتخصصة …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر أعضاء المجموعة الأورام أمراض النساء لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. وهذا العمل في جزء يدعمها تمويل من الصحة الوطنية ومجلس البحوث الطبية، والمجلس الأسترالي للأبحاث، ومعهد السرطان في نيو ساوث ويلز (PST). عضو الكنيست هي المستفيدة من جامعة نيوكاسل الدراسات العليا زمالة أبحاث.
Materials
| 24 well plates | Corning, USA | 3524 | can be purchased from other vendors |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | can be purchased from other vendors |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Interpath, Australia | SH30034.02 | 10% FBS used in culture medium |
| L-Glutamine | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034.01 | 1% concentration used |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentration used |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrane (0.8 mm) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µM concentration used |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS for use. TOXIC – wear gloves and cannot be disposed of in the sink |
| Ethanol | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, make 25, 50 and 75% with milliQ water. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Very viscous, careful while dispensing |
| Di-Sodium Hydrogen Phosphate | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | can be purchased from other vendors |
| Sodium Di-hydrogen Phosphate | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | can be purchased from other vendors |
| Sodium Chloride | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | can be purchased from other vendors |
| Cytokeratin8/Troma I | Developmental Studies Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in blocking buffer |
| active βcatenin | Cell Signalling Technology, USA | D13A1 | 1:200 in blocking buffer |
| Phospho-Histone3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in blocking buffer |
| Alexa488 Goat anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in blocking buffer |
| Alexa594 Goat anti-Rat IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in blocking buffer |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | can be purchased from other vendors |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370 | – |
| 2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Use to stain nucleic acids (DNA) |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Solvent |
| Cover Slips (24×50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | – |
References
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal development of the Wolffian/epididymal duct by using transgenic mice. Asian J Androl. 17, 1-7 (2015).
- Carroll, T. J., Park, J. S., Hayashi, S., Majumdar, A., McMahon, A. P. Wnt9b plays a central role in the regulation of mesenchymal to epithelial transitions underlying organogenesis of the mammalian urogenital system. Dev Cell. 9, 283-292 (2005).
- Kumar, M., Syed, S. M., Taketo, M. M., Tanwar, P. S. Epithelial Wnt/βcatenin signalling is essential for epididymal coiling. Dev Biol. 412, 234-249 (2016).
- Murashima, A., et al. Essential roles of androgen signaling in Wolffian duct stabilization and epididymal cell differentiation. Endocrinology. 152, 1640-1651 (2011).
- Lin, J. H. Applications and limitations of genetically modified mouse models in drug discovery and development. Curr Drug Metab. 9, 419-438 (2008).
- Rak-Raszewska, A., Hauser, P. V., Vainio, S. Organ In Vitro Culture: What Have We Learned about Early Kidney Development?. Stem Cells Int. 959807, 1-16 (2015).
- Hirashima, T., Adachi, T. Procedures for the Quantification of Whole-Tissue Immunofluorescence Images Obtained at Single-Cell Resolution during Murine Tubular Organ Development. PLoS One. 10, 0135343 (2015).
- Chan, W. Y., Blomberg, L. A. Germline Development: Methods and Protocols. Methods Mol Biol. 825, (2012).
- Karner, C. M., et al. Tankyrase Is Necessary for Canonical Wnt Signaling During Kidney Development. Dev Dyn. 239, 2014-2023 (2010).
- Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nat Med. 14, 979-984 (2008).
