ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד
Summary
כתב יד זה מספק פרוטוקולים המשתמשים ב electroporation ברחם (IUE) כדי לתאר את הקישוריות המבנית של נוירונים ברמת התא בודד ועל הרגישויות של נוירונים שכותרתו fluorescently. היסטולוגיה משמש כדי לאפיין הדנדריטים ותחזיות axonal. הקלטה כל התא פרוס חריפה משמשת לחקור רגישות.
Abstract
מערכת העצבים מורכבת של מגוון עצום של סוגי נוירונים ברורים. תת-אוכלוסיות נוירונים אלו מתאפיינות, בין שאר התכונות, מורפולוגיות הדנדריטים הנבדלות, דפוסים מסוימים שלהם של קישוריות אקסונלית, ותגובות ירי סלקטיווי שלהם. המנגנונים המולקולריים תאיים האחראים על היבטים אלה של בידול במהלך פיתוח עדיין הם הבינו היטב.
כאן אנו מתארים פרוטוקולים משולבים תיוג ואפיון הקישוריות המבנית הרגיש של נוירונים בקליפת המוח. שינוי של electroporation ברחם (IUE) הפרוטוקול מאפשר תיוג של אוכלוסייה דלילה של נוירונים. זה, בתורו, מאפשר זיהוי ומעקב של דנדריטים אקסונים של נוירונים בודדים, אפיון מדויק של מיקום למינרית של תחזיות axonal, וניתוח morphometric. IUE יכול לשמש גם כדי לחקור שינויים הרגישים שלWild-type (WT) או נוירונים מהונדסים גנטית על ידי שילוב עם הקלטה כל תא מן פרוסות חריפה של המוח electroporated. שתי טכניקות אלה תורמות להבנה טובה יותר של הצימוד של קישוריות מבנית ותפקודית ושל המנגנונים המולקולריים השולטים גיוון עצבי במהלך פיתוח. יש תהליכים התפתחותיים אלו השלכות חשובות על חיווט axonal, את המגוון הפונקציונלי של נוירונים, לבין הביולוגיה של פרעות קוגניטיביות.
Introduction
פיתוח המבנים דנדריטים אקסונלית הוא היבט חשוב של תקנה מעגלת במערכת העצבים, כולל בקליפת המוח. זה ממלא תפקיד חיוני במהלך החיווט סלקטיבית של תת-אוכלוסיות נוירונים המגוונות. מספר דיווחים עדכניים הראו כי, בנוסף לקישוריות, המגוון המולקולרי של נוירונים משתקף רכישת מצבים מאוד ספציפיים של ירי. עם זאת, המנגנונים לקביעת הרגישות והקישוריות של תת העצבית הברורה במהלך פיתוח, כמו גם מידת התיאום שלהם, הם עדיין לא ידועים ולא מובן 1, 2.
בשנת vivo loss- ולהשיג של פונקצית המנתח לאפשר לחקר היחסים בין רמת הביטוי של גנים ספציפיים והשפיעו בפיתוח של המעגל. ברחם electroporation (IUE) היא טכניקה בשימוש נרחב ללמודהפונקציה של גן של עניין אוכלוסיות נוירונים ספציפיות כדי לחקור את הדפוסים הכוללים של הקישוריות שלהם. עם זאת, כדי לקבוע את המאפיינים המורפולוגיים של אקסונים דנדריטים בשכבות קליפת המוח בעכברים חיים, חיוני לתייג נוירונים בדלילות. מערכת רקומבינציה Cre בשילוב עם IUE יכול לשמש כדי לסמן אוכלוסייה דלילה של נוירונים בצפיפות נמוכה מספיק כדי לפתור את התחזיות נפלטות תאים בודדים של laminas קליפת המוח המזוהית. שיטה זו תוויות מספר מספיק של נוירונים לכל קליפה לקבל נתונים כמותיים לאחר הניתוח של מספרים סבירים של מוח electroporated (איור 1). כתב יד זה מציג שיטה לניתוח קנס כזה של קישוריות. הוא גם מציג אסטרטגיה דומה לנתח, בניסויים נפרדים, את התכונות החשמליות של נוירונים על ידי ביצוע הקלטות מהדק הנוכחי על חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) -electroporated תאים פרוסים קליפת מוח חריף. אלה הפרוtocols הם מגוונים וניתן להחיל את המחקר של הרגישות והקישוריות של נוירונים של חיות WT ו מהונדסות, וגם של נוירונים אשר הפסדים ורווחים של פונקציה הם הציגו על ידי פלסמידים נוספים במהלך IUE.
למרות בפרוטוקול זה מתאר את electroporation של עכברים ביום עובריים (E) 15.5, טכניקה זו יכולה להתבצע בכל גיל בין 3 E9.5 ויום לאחר הלידה (P) 2 4. בעוד electroporation ב מוקדם בשלבי מטרות נוירונים ומבשרים בתלמוס רבדים עמוקים של קליפת המוח, הנמצאים בשלבים סימני electroporation בשכבות שטחיות יותר (למשל, שכבת מטרות E15.5 IUE II-III נוירונים). לסיכום, השילוב של IUE עם ניתוח מורפולוגי תא בודד ו אלקטרופיזיולוגיה הוא כלי שימושי כדי להבהיר את המנגנונים המולקולריים שבבסיס המגוון מבני ותפקודי העצום של נוירונים במערכת העצבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לתייג נוירונים של הקליפה החושית של עכברי C75BL / 6 כדי לנתח הקישוריות שלהם הרגישה שלהם. עם כל כבוד לשיטות קיימות, היא מדמיין היבטים להפלות של קישוריות, כגון מספר הסניפים אקסונלית לכל נוירון, הטופוגרפיה המדויקת שלהם, ואת המיקום האנטומי שלהם. ע?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים ר 'גוטיירז וא מוראלס לקבלת הסיוע הטכני המעולה שלהם ללוס אנג'לס וייס לעריכה. CGB ממומן על ידי דואר ספרדית Ministerio דה Ciencia Innovacion (MICINN), FPI-BES-2,012-056,011. עבודה זו מומנה על ידי מענק מטעם BBVA קרן SAF2014-58598-JIN (MINECO) למ 'Navarrete ועל ידי מענק מטעם רמון Areces קרן ומענקים SAF2014-52119-R ו- BFU2014-55738-REDT (מ MINECO) כדי מ Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
- Dehorter, N., et al. Tuning of fast-spiking interneuron properties by an activity-dependent transcriptional switch. Science. 349 (6253), 1216-1220 (2015).
- Rodriguez-Tornos, F. M., et al. Cux1 Enables Interhemispheric Connections of Layer II/III Neurons by Regulating Kv1-Dependent Firing. Neuron. 89 (3), 494-506 (2016).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Sonego, M., Zhou, Y., Oudin, M. J., Doherty, P., Lalli, G. In vivo postnatal electroporation and time-lapse imaging of neuroblast migration in mouse acute brain slices. J Vis Exp. (81), (2013).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-,Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), (2016).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. (31), (2009).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. J Vis Exp. (44), (2010).
- Woodworth, M. B., et al. Ctip1 Regulates the Balance between Specification of Distinct Projection Neuron Subtypes in Deep Cortical Layers. Cell Rep. 15 (5), 999-1012 (2016).
- Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons. Neuron. 53 (5), 639-647 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (3), 1027-1032 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Saito, T. In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system. Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).
- Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation. Dev Growth Differ. , (2015).
- Miller, M. Maturation of rat visual cortex. I. A quantitative study of Golgi-impregnated pyramidal neurons. J Neurocytol. 10 (5), 859-878 (1981).
- Miller, M., Peters, A. Maturation of rat visual cortex. II. A combined Golgi-electron microscope study of pyramidal neurons. J Comp Neurol. 203 (4), 555-573 (1981).
- Cubelos, B., et al. Cux-2 controls the proliferation of neuronal intermediate precursors of the cortical subventricular zone. Cereb Cortex. 18 (8), 1758-1770 (2008).
- Kang, J. Y., Kawaguchi, D., Wang, L. Optical Control of a Neuronal Protein Using a Genetically Encoded Unnatural Amino Acid in Neurons. J Vis Exp. (109), (2016).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Maravall, M., Stern, E. A., Svoboda, K. Development of intrinsic properties and excitability of layer 2/3 pyramidal neurons during a critical period for sensory maps in rat barrel cortex. J Neurophysiol. 92 (1), 144-156 (2004).
- Karadottir, R., Attwell, D. Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage. Nat Protoc. 1 (4), 1977-1986 (2006).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
