La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula
Summary
Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.
Abstract
El sistema nervioso se compone de una enorme gama de tipos neuronales distintas. Estas subpoblaciones neuronales se caracterizan por, entre otras características, sus morfologías dendríticas distintas, sus patrones específicos de conectividad axonal, y sus respuestas de disparo selectivo. Los mecanismos moleculares y celulares responsables de estos aspectos de la diferenciación durante el desarrollo son aún poco conocidos.
A continuación, describimos los protocolos combinados para el etiquetado y la caracterización de la conectividad estructural y la excitabilidad de las neuronas corticales. Modificación del protocolo de electroporación en el útero (IUE) permite el etiquetado de una población escasa de las neuronas. Esto, a su vez, permite la identificación y el seguimiento de las dendritas y axones de las neuronas individuales, la caracterización precisa de la ubicación laminar de proyecciones axonales, y el análisis morfométrico. IUE también se puede utilizar para investigar los cambios en la excitabilidad de lasDe tipo salvaje (WT) o neuronas genéticamente modificadas mediante la combinación con células enteras de grabación de rodajas agudas de cerebros electroporación. Estas dos técnicas contribuyen a una mejor comprensión del acoplamiento de la conectividad estructural y funcional y de los mecanismos moleculares que controlan la diversidad neuronal durante el desarrollo. Estos procesos de desarrollo tienen importantes implicaciones en el cableado axonal, la diversidad funcional de las neuronas, y la biología de los trastornos cognitivos.
Introduction
El desarrollo de estructuras dendríticas y axonales es una faceta importante de la regulación del circuito en el sistema nervioso, incluyendo en la corteza cerebral. Desempeña un papel crítico durante el cableado selectiva de las diversas subpoblaciones neuronales. Varios informes recientes han demostrado que, además de la conectividad, la diversidad molecular de las neuronas se refleja por la adquisición de modos muy específicos de disparo. Sin embargo, los mecanismos que determinan la excitabilidad y la conectividad de los subtipos neuronales distintas durante el desarrollo, así como su grado de coordinación, son aún poco conocidos 1, 2.
In vivo deficitaria y ganancia de función analiza permite el estudio de la relación entre el nivel de expresión de genes específicos y su influencia en el desarrollo del circuito. Electroporación en el útero (IUE) es una técnica ampliamente utilizada para estudiarla función de un gen de interés en las poblaciones neuronales específicas y para estudiar los patrones generales de su conectividad. Sin embargo, para determinar las características morfológicas de los axones y dendritas en las capas corticales en ratones vivos, es esencial para etiquetar las neuronas escasamente. Un sistema de recombinación Cre combinado con IUE puede ser utilizado para marcar una población escasa de las neuronas a una densidad suficientemente baja para resolver las proyecciones emitidas por las células individuales de las láminas corticales identificados. Este método etiquetas de un número suficiente de neuronas por la corteza para obtener datos cuantitativos después del análisis de un número razonable de los cerebros de electroporación (Figura 1). Este manuscrito presenta un método para tal análisis fino de la conectividad. También presenta una estrategia similar para analizar, en experimentos separados, las propiedades eléctricas de las neuronas mediante la realización de grabaciones de corriente-clamp en la proteína de fluorescencia verde (GFP) -electroporated células de rodajas corticales agudas. estos protocoles son versátiles y pueden aplicarse al estudio de la excitabilidad y la conectividad de las neuronas de los animales WT y transgénicos, y también de las neuronas en el que las pérdidas y ganancias de la función se introducen por los plásmidos adicionales durante IUE.
Aunque este protocolo describe la electroporación de los ratones en el día embrionario (E) 15,5, esta técnica se puede realizar a cualquier edad entre E9.5 y 3 días postnatal (P) 2 4. Mientras que en las primeras etapas de la electroporación se dirige a las neuronas y los precursores del tálamo y las capas profundas de la corteza, una etapa más avanzada marcas de electroporación capas más superficiales (por ejemplo, neuronas E15.5 IUE capa objetivos II-III). En resumen, la combinación de IUE con análisis morfológico de una sola célula y electrofisiología es una herramienta útil para dilucidar los mecanismos moleculares que subyacen a la enorme diversidad estructural y funcional de las neuronas en el sistema nervioso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe con detalle cómo etiquetar las neuronas de la corteza somatosensorial de / 6 ratones C75BL con el fin de analizar su conectividad y su excitabilidad. Con respecto a los métodos existentes, visualiza los aspectos discriminatorios de conectividad, tales como el número de ramas axonales por neurona, su topografía precisa, y su localización anatómica. Mediante la alteración de la posición de los electrodos, es posible apuntar a otras poblaciones de neuronas, tales como la corteza cingulada (m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a R. Gutiérrez y A. Morales por su excelente asistencia técnica y a LA Weiss para su edición. CGB está financiado por el Ministerio español de Ciencia e Innovación (MICINN), FPI-BES-2012-056011. Este trabajo fue financiado por una beca de la Fundación BBVA y SAF2014-58598-JIN (MINECO) para M. Navarrete y por una beca de la Fundación Ramón Areces y subvenciones SAF2014-52119-R y BFU2014-55738-Redt (de MINECO) a M. Nieto.
Materials
| pCAG-Cre | Addgene | 13775 |
| pCALNL-GFP | Addgene | 13770 |
| pCAG-DsRed2 | Addgene | 15777 |
| pCAG-GFP | Addgene | 11150 |
| Fast Green | Carl Roth | 301.1 |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 |
| Carprofen (Rimadyl) | Pfizer GmbH | 1615 ESP |
| Isoflurane (IsoFlo) | Abbott (Esteve) | 1385 ESP |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | 2528-ESP |
| Xylazine (Xilagesic) | Calier | 0682-ESP |
| Povidone Iodine | Meda | 694109.6 |
| Eye Ointment (Lipolac) | Angelini | 65.277 |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco by Life Technologies | 24020-091 |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma -Aldrich | P4333 |
| Scalpel Handle #3 – 12cm | Fine Science Tools | 10003-12 |
| Scalpel Blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 |
| Adson Forceps-Serrated – Straight 12 cm | Fine Science Tools | 1106-12 |
| Hardened Fine Scissors – Straight 11 cm | Fine Science Tools | 14090-11 |
| Scissors Mezenbaum-Nelson Curved L=14,5cm | Teleflex | PO143281 |
| Thin curved tips – Style 7 Dumoxel | Dumont | 0303-7-PO |
| Dumont #5 Forceps-Inox | Fine Science Tools | 11251-20 |
| Mathieu Needle Holder – Serrated | Fine Science Tools | 12010-14 |
| AutoClip Applier | Braintree scientific, Inc | ACS APL |
| 9mm AutoClips | MikRon Precision, Inc. | 205016 |
| Sutures – Polysorb 6-0 | Covidien | UL-101 |
| Electric Razor | Panasonic | ER 240 |
| Borosilicate glass capillaries (100mm, 1.0/0.58 Outer/Inner diameter) | Wold Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma -Aldrich | A5177-5EA |
| Gauze (Aposan) | Laboratorios Indas, S.A.U. | C.N. 482232.8 |
| Cotton Swabs (Star Cott) | Albasa | – |
| Needle 25G (BD Microlance 3) | Becton, Dickinson and Company | 300600 |
| Sucrose | Sigma -Aldrich | S0389 |
| Paraformaldehyde | Sigma -Aldrich | 158127 |
| OCT Compound | Sakura | 4583 |
| Tissue Culture Dish 100 x 20 mm | Falcon | 353003 |
| GFP Tag Polyclonal Antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11122 |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A-11008 |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270106 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML |
| Electroporator ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0002 |
| Platinum electrodes 650P 7 mm | Nepagene | CUY650P7 |
| Microscope for Fluorescent Imaging – MZ10F | Leica | – |
| VIP 3000 Isofluorane Vaporizer | Matrx | – |
| TCS-SP5 Laser Scanning System | Leica | – |
| Axiovert 200 Microscope | Zeiss | – |
| Cryostat – CM 1950 | Leica | – |
| P-97 Micropette Puller | Sutter Instrument Company | P-97 |
| Patch clamp analysis softwarw (p-Clamp Clampfit 10.3) | Molecular Devices | – |
| Acquisition software (MultiClamp 700B Amplifier) | Molecular Devices | DD1440A |
| Motorized Micromanipulator + Rotating Base | Sutter Instrument | MP-225 |
| Air Table | Newport | – |
| Miniature Peristaltic Pumps | WPI | – |
References
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