Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

In medisch onderzoek wordt veel aandacht besteed aan membraaneiwitten, intrinsiek of extrinsiek betrokken bij diverse lipide interacties. Werken met lipide-interagerende eiwitten omvat hetzij het selecteren van een alternatief voor de lipiden, zoals detergenten, amphipols ¹ of ² kleine eiwitten, of het vinden van een alternatief membraan dat het eiwit oplosbaar en actief houdt. Lipoic membraan substituten omvatten liposomen en nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs zijn near-native membraan platforms ontwikkeld door engineering van het eiwit gedeelte, ApoA-1, van de high-density lipoproteïne (HDL) die van nature in het bloed. ApoA-1 is een 243 residu-lange keten korte amfipathische α-helices en een lipide-oplosbaar vrij conformatie. In vitro als in aanwezigheid van lipiden, twee kopieën van het eiwit ApoA-1 spontaan herschikken de hydr omcirkelenophobic acylketen gedeelte van een lipide bilaag patch ^5. Gemanipuleerde versies van ApoA-1 worden over het algemeen genoemd membraan scaffolding eiwitten (MSP) en steeds zijn in de handel verkrijgbaar als plasmiden of gezuiverde eiwitten. Herhalingen of deleties van de α-helices in ApoA-1 resulteren in een langere of kortere ^{6 7} membraan steigers eiwitten. Dit maakt het weer mogelijk om schijven te vormen ongeveer 6 nm ^7-17 nm ⁸ in diameter. Er zijn verschillende soorten van de aanvragen voor de nanodiscs ^{3, 9.} De meest gebruikte toepassing is het een bijna-natieve membraan omgeving voor het stabiliseren van een integraal membraaneiwit ^8, voorheen ^{3, 9} beoordeeld verschaffen. Een minder onderzocht gebruik een nanoschaal membraanoppervlak te verschaffen voor de studie vanperifere membraaneiwitten ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Deel 1 van het protocol hieronder visualiseert de procedure voor het maken van nanodiscs samengesteld uit fosfolipiden en membraan steigers eiwit.

Monstervoorbereiding is een knelpunt in de meeste methoden. Methode-specifieke monsters kunnen bepaalde informatie toe te voegen, maar ze ook vergelijkingen van de resultaten bemoeilijken. Daarom is het eenvoudiger wanneer monsters multimodale en kan direct worden gebruikt in verschillende methoden. Een voordeel van het gebruik van nanodiscs is de geringe omvang van de nanodisc vergeleken met liposomen (bijvoorbeeld kunnen de monsters direct worden gebruikt voor zowel TEM en niet-denaturerende gelelektroforese, zoals in het onderhavige protocol).

<p class = "jove_content"> blaasjes en liposomen zijn lang gebruikt om de functie van membraan- interagerende eiwitten te begrijpen. Structurele studies en visualisatie, een voorbeeld van de structuurbepaling van een transmembraaneiwit in liposomen beschikbaar ^18. Echter geen hoge-resolutie 3D-structuur van een monotopic membraaneiwit ingesloten in een liposoom membraan nog niet gepubliceerd, voor zover wij weten. Goud nanodeeltjes of antilichamen kunnen worden gebruikt om eiwitten binden aan liposomen of blaasjes via TEM ¹⁹ visualiseren. Hoewel deze probes zeer specifiek zijn, kunnen ze interfereren met membraan-bindende eiwitten door veiling het membraan bindingsplaats of maskeren gebieden van belang met de flexibele onderdelen. Goud-gemerkte antilichaam gecomplexeerd of eiwitten kan waarschijnlijk worden geanalyseerd op een gel, maar dit zou de kosten van het experiment te verhogen.

Hoewel liposomen zijn een uitstekend platform, kan men niet zeker dat de pop te zijnning een bepaalde verhouding eiwit per liposoom, een eigenschap die kan worden onderzocht door het gebruik van nanodiscs ^20. In een liposoom, kan cofactoren en substraten worden gevangen in de oplosbare interieur. Stoffen die oplosbaar membraan zal hetzelfde lot beide typen membraan mimetica delen. Daar de bilaag kleiner is in nanodiscs, een kleinere hoeveelheid stof nodig is om de membranen nanodisc verzadigen.

Begrip eiwitfunctie door het bepalen van de atomaire structuur is essentieel geweest voor vele vakgebieden. Methoden voor eiwitstructuur bepaling onder X-ray ^21; kernmagnetische resonantie (NMR) ^{22, 23;} en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) ²⁴ bij cryogene temperaturen, cryoEM. De resolutie van cryoEM is de laatste tijd sterk verbeterd, voornamelijk als gevolg van het gebruik van directe electron detectors ^{25, 26.} De macromoleculen worden afgebeeld in dunne, glasvocht ijs ²⁷ in een near-native staat. Vanwege het lage contrast van biologische moleculen, worden ze moeilijk te detecteren met afmetingen van 100-200 kDa. Voor voldoende grote monsters kan gegevensverzameling gedaan en de methode van afzonderlijke deeltjes reconstructie kan worden toegepast op een structuur ²⁸ te verkrijgen.

De bepaling van de eiwitstructuur door TEM is een meerdere stappen. Het begint meestal met de evaluatie van monster monodispersiteit door negatieve vlek TEM ²⁹ met behulp van zouten van zware metalen zoals phosphotungsten (PT) ³⁰ of ³¹ uranium. Reconstructie van een lage resolutie model van de negatief gekleurde macromolecuul wordt meestal gemaakt en kunnen belangrijke informatie opleveren over de moleculaire structuur ^29. Tegelijkertijdhet verzamelen van gegevens met behulp van cryoEM kan beginnen. Voorzichtigheid is geboden bij de beoordeling van negatieve vlek TEM gegevens naar de verkeerde interpretatie van artefact vorming te voorkomen. Eén specifiek artefact is het effect van de PT vlek op fosfolipiden en liposomen ^32, resulterend in de vorming van lange staven gelijkend stapels muntstukken van de zijkant ^33. Dergelijke "rouleau" of "stacks" (hierna aangeduid als "stacks") werden vroeg waargenomen voor HDL ^34, en later ook nanodiscs ^35.

Het stapelen en herziening van membranen kunnen optreden om vele redenen. Zo kan worden geïnduceerd door co-factoren zoals koper, getoond door TEM beeldvorming in een ammoniummolybdaat vlek ^36. Een fractie van de membraanlipiden in liposomen bevatte een iminodiazijnzuur kopgroep nabootsen metaal complexatie met EDTA, waardoor stapelen liposomen na de toevoeging van koperionen <sup class = "xref"> 36. Stapelen kan ook worden veroorzaakt door een eiwit-eiwit interacties door een eiwit in of op de lipide bilagen (gebruikte vlek niet genoemd) ^37. De vorming stack van fosfolipiden door PT werd al vroeg waargenomen; echter, heeft later werkzaamheden gericht op het verwijderen of afschaffing van deze formatie artefact ^38.

Hier stellen we een werkwijze om te profiteren van de NAPT-geïnduceerde nanodisc stapelen voor de studie van membraan-bindende eiwitten door TEM. In het kort, zou eiwit bindend voor de nanodiscs voorkomen dat de nanodiscs van het stapelen. Hoewel de redenen voor het stapelen niet duidelijk is voorgesteld ³⁹ dat er een elektrostatische interactie tussen de fosfolipiden en de fosforylgroep van PT, waardoor de schijven aan elkaar kleven (Figuur 1A). De hypothese achter ons protocol is dat wanneer een eiwit bindt aan een nanodisc meeste fosfolipidenoppervlak niet beschik woordelijk voor de interactie met de PT als gevolg van sterische hindering door het eiwit. Dit zou stack vorming (figuur 1B) te voorkomen. kunnen twee conclusies worden getrokken. Ten eerste, het voorkomen van stapeling betekent dat het eiwit van belang gebonden is aan het membraan. Ten tweede kan het eiwit-ND complex worden behandeld met standaard single-deeltje verwerkingsmethoden ^{24, 40} een ruwe morfologie van het complex te krijgen. Bovendien analyseert door methoden zoals niet-denaturerende gelelektroforese of dynamische lichtverstrooiing kan worden uitgevoerd.

Om deze hypothese te tonen gebruikten we de membraan bindingseiwit 5-lipoxygenase (5LO), dat betrokken is bij vele ontstekingsziekten ^{41, 42.} Het 78-kDa eiwit vereist calciumionen te binden aan het membraan ^43. Hoewel dit membraan vereniging is onderzocht veelvuldig gebruik van liposomens = "xref"> ^{44, 45, 46} en membraanfracties ^47, deze kan niet worden gebruikt voor TEM analyse en structuurbepaling.

De bereiding van nanodiscs begint door het mengen van MSP met lipide gesuspendeerd in het wasmiddel natriumcholaat. Na incubatie op ijs gedurende 1 uur, wordt het detergens langzaam uit de reconstitutie mengsel met een adsorbens hars. Dit soort materiaal wordt vaak gemaakt van polystyreen gevormd tot kleine kralen. Ze zijn relatief hydrofoob en hebben een sterke voorkeur voor binding detergent ten opzichte van lipiden ^48. Na verwijdering van het hydrofobe kralen en uitvoeren klaring door middel van centrifugatie worden de nanodiscs gezuiverd door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC). De gezuiverde nanodiscs worden gemengd met een monotopic membraaneiwit (en eventuele cofactoren) in een equimolaire ratio (ratio of meerdere voor een titratie) en worden overgelaten aan rEACT (15 min). Analyse door TEM wordt uitgevoerd door het toepassen van ul-hoeveelheden van het monster op glow-ontladen, koolstof beklede roosters en vervolgens door het uitvoeren van negatieve kleuring met NAPT uitgevoerd. Hetzelfde monster uit als de hoeveelheden werden toegepast op de TEM roosters kan worden gebruikt voor analyse door niet-denaturerende of SDS PAGE-gel-elektroforese, en door verschillende soorten activiteitsmetingen, zonder grote veranderingen.

Protocol

1. Bereiding van nanodiscs Expressie en zuivering van het membraan eiwit steigers 8, 35 De His-tag MSP1E3D1 in de E. coli BL21 (DE3) T1R pRARE2 stam in kolven te uiten. Bereid een 50 ml overnacht starterkweek met LB medium aangevuld met 50 ug / ml kanamycine bij 37 ° C. Verdun de nacht startercultuur in 2 L van geweldige kweekmedium gesupplementeerd met 50 ug / ml kanamycine. Groeien de cellen bij 37 ° C totdat de optisch…

Representative Results

De werkwijze die we voorstellen is afhankelijk van de opstelling van nanodiscs op het membraanoppervlak voor monotopic membraan-eiwitbinding verschaffen. Aangezien er geen transmembraaneiwit ingebed in de nanodisc lipide bilaag, worden de nanodiscs hier aangeduid als "lege nanodiscs" (Figuur 2A). Deze hebben een berekend molecuulgewicht van 256 kDa voor een samenstelling van twee MSP1E3D1 steigers eiwitten en ongeveer 260 moleculen van POPC 8….

Discussion

De werkwijze kan worden onderverdeeld in drie delen: de reconstructie van lege nanodiscs, de bereiding van eiwit-complexen nanodisc en de negatieve kleuring voor de TEM van deze complexen. Elk onderdeel zal afzonderlijk worden behandeld met betrekking tot beperkingen van de techniek, kritische stappen en nuttige wijzigingen.

Reconstructie van lege nanodiscs. Kritische stappen en beperkingen in de productie en het gebruik van nanodiscs.

Voor de bereiding van de lege …

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid:POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate	500 mM Sodium cholate		Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock	50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl		Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer	20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA		Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8	BN2001	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250	BN2002	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer	50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S	BN2003	Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer	25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS		Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer	0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol		Inhouse receipe
Terrific broth	Tryptone – 12.0g Yeast Extract – 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol – 4 mL		Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium