Méthode pour visualiser et analyser membrane protéines interagissant par microscopie électronique à transmission

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

Dans la recherche médicale, une grande attention est focalisée sur des protéines membranaires, soit intrinsèques ou extrinsèques, impliqués dans une variété d'interactions lipidiques. En travaillant avec des protéines interagissant lipides comprend soit la sélection d' un substitut aux lipides, tels que les détergents, amphipols ¹ ou ² petites protéines ou de trouver un substitut à membrane qui maintient la protéine soluble et active. Substituts de la membrane lipoïque comprennent des liposomes et nanodiscs (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscs sont des plates-formes de membranes quasi-native développée par ingénierie de la partie protéique, ApoA-1, de la lipoprotéine de haute densité (HDL) dans le sang d'origine naturelle. ApoA-1 est un résidu 243-longue chaîne de courtes hélices a amphipathiques et présente une conformation soluble délipidé. In vitro lorsqu'ils sont en présence de lipides, de deux copies de la protéine d' ApoA-1 réarranger spontanément à entourer le hydrpartie de la chaîne acyle ophobic d'un bicouche lipidique correctif ^5. versions d'ingénierie de ApoA-1 sont généralement appelés échafaudages de protéines membranaires (MSP), et un nombre croissant sont disponibles dans le commerce sous forme de plasmides ou des protéines purifiées. Répétitions ou suppressions des hélices dans ApoA-1 résultat à plus ou moins ⁶ protéines d'échafaudage ⁷ membranaires. Ceci à son tour permet de former des disques d' environ 6 nm à 17 nm à ^{7 8} de diamètre. Il existe différents types d'applications pour le nanodiscs ^{3, 9.} L'application la plus couramment utilisée est de fournir un environnement membranaire quasi-native pour la stabilisation d'une protéine membranaire intégrale ^8, examiné précédemment ^{3, 9.} Une utilisation moins explorée est de fournir une surface de la membrane à l'échelle nanométrique pour l'étude demembrane périphérique des protéines ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} L'article 1 du protocole ci-dessous permet de visualiser la procédure de prise de nanodiscs composé de phospholipides et de protéines d'échafaudage de la membrane.

La préparation des échantillons est un goulot d'étranglement dans la plupart des méthodes. échantillons spécifiques Méthode peuvent ajouter des informations particulières, mais ils font également la comparaison des résultats difficile. Par conséquent, il est plus simple lorsque les échantillons sont multimodaux et peuvent être utilisés directement dans plusieurs méthodes différentes. Un avantage à l'utilisation de nanodiscs est la petite taille de l'nanodisc par rapport aux liposomes (par exemple, les échantillons peuvent être directement utilisés pour les TEM et électrophorèse sur gel non dénaturant, comme dans le présent protocole).

<p class = "jove_content"> vésicules et des liposomes sont utilisés depuis longtemps pour comprendre la fonction des protéines de la membrane en interaction. Pour des études structurales et de visualisation, un exemple de la détermination de la structure d'une protéine transmembranaire dans des liposomes ¹⁸ est disponible. Cependant, aucune structure 3D à haute résolution d'une protéine de membrane monotopique embarqué sur une membrane de liposome a été encore publié, pour autant que nous le savons. Des nanoparticules d' or ou d' anticorps peuvent être utilisés pour visualiser les protéines de liaison à des liposomes ou des vésicules en utilisant TEM ^19. Même si ces sondes sont très spécifiques, ils pourraient interférer avec les protéines membranaires de liaison en voilant le site de liaison de la membrane ou en masquant les zones d'intérêt avec les parties flexibles. Or marqué ou des protéines d'anticorps complexée pourrait probablement être analysé sur un gel, mais cela augmenterait le coût de l'expérience.

Bien que les liposomes sont une excellente plate-forme, on ne peut être certain que la population a un rapport particulier de protéines par liposome, une caractéristique qui peut être explorée par l'utilisation de nanodiscs ^20. Dans un liposome, des cofacteurs et des substrats peuvent être piégés à l'intérieur soluble. Les substances qui sont solubles dans la membrane se partageront le même sort pour les deux types de mimétiques membranaires. Cependant, comme la zone à deux couches est inférieure à nanodiscs, une petite quantité de substance nécessaire pour saturer les membranes nanodisc.

Comprendre la fonction des protéines grâce à la détermination de la structure atomique a été essentielle pour de nombreux domaines de la recherche. Méthodes de détermination de la structure des protéines comprennent des rayons X ^21; résonance magnétique nucléaire (RMN) , ^{22, 23;} et par microscopie électronique à transmission (MET) ²⁴ à des températures cryogéniques, cryoEM. La résolution par cryoEM a récemment été grandement améliorée, principalement en raison de l'utilisation d'électrons de directetecteurs ^{25, 26.} Les macromolécules sont imagés dans mince, glace vitreuse ²⁷ dans un état quasi-native. Toutefois, en raison du faible contraste entre les molécules biologiques, elles deviennent difficiles à détecter dans la gamme de tailles de 100-200 kDa. Pour les échantillons de taille appropriée, la collecte des données peut être effectuée et le procédé de reconstruction de la particule peut être appliquée pour obtenir une structure ^28.

Cependant, la détermination de la structure protéique par MET est un processus en plusieurs étapes. Elle débute généralement par l'évaluation de l' échantillon monodispersité par coloration négative TEM ²⁹ en utilisant des sels de métaux lourds comme phosphotungsten (PT) ³⁰ ou de l' uranium ^31. Reconstruction d'un modèle à faible résolution de la macromolécule colorées négativement est généralement faite et peut fournir des informations importantes sur la structure moléculaire ^29. En parallèle,la collecte de données en utilisant cryoEM peut commencer. Des précautions doivent être prises lors de l'évaluation des données TEM coloration négative pour éviter la mauvaise interprétation de la formation artefact. Un artefact particulier est l'effet de la tache de PT sur des phospholipides et des liposomes ^32, ce qui entraîne la formation de longues tiges ressemblant à des piles de pièces de monnaie vues du côté ^33. Un tel "rouleau" ou "piles" (ci – après désigné par "piles") ont été observées au début de HDL ^34, et plus tard aussi pour nanodiscs ^35.

L'empilement et un remodelage des membranes peuvent se produire pour de nombreuses raisons. Par exemple, elle peut être induite par des co-facteurs tels que le cuivre, montré par imagerie MET dans un molybdate d' ammonium ³⁶ tache. Une fraction des lipides de la membrane dans des liposomes contient un groupe de tête iminodiacétique mimant complexation des métaux par l'EDTA, l'empilement ainsi des liposomes après l'addition d'ions cuivre <sup class = "xref"> 36. Gerbage peut aussi être due à une interaction protéine-protéine d'une protéine dans ou sur les bicouches lipidiques (le colorant utilisé est non mentionné) ^37. La formation de la pile de phospholipides par PT a été observée dès le début; Cependant, le travail plus tard , a mis l' accent sur la suppression ou la suppression de cette formation d'artefact ^38.

Ici, nous proposons une méthode pour tirer parti de la nanodisc NaPT induite par empilement pour l'étude des protéines membranaires de liaison par MET. En bref, la liaison sur les protéines nanodiscs empêcherait les nanodiscs d'empilement. Bien que les raisons de l'empilement ne sont pas claires, il a été proposé ³⁹ qu'il y ait une interaction électrostatique entre les phospholipides et le groupe phosphoryle du PT, ce qui provoque les disques à coller à l'autre (figure 1A). L'hypothèse derrière notre protocole est que, quand une protéine se lie à une nanodisc, la majeure partie de la surface phospholipide est non disponi ble pour l'interaction avec le terminal en raison de l'encombrement stérique de la protéine. Cela permettrait d' éviter la formation pile (figure 1B). Deux conclusions peuvent être tirées. En premier lieu, la prévention de l'empilement signifie que la protéine d'intérêt est liée à la membrane. En second lieu , le complexe protéine-ND peut être traitée par des procédés classiques de traitement unique de particules ^{24, 40} pour obtenir une morphologie grossière du complexe. En outre, des analyses par des méthodes telles que la non-dénaturant électrophorèse sur gel ou la diffusion dynamique de la lumière peut être réalisée.

Pour démontrer cette hypothèse, nous avons utilisé la protéine de liaison à la membrane 5-lipoxygénase (5LO), qui est impliqué dans de nombreuses maladies inflammatoires ^{41, 42.} Cette protéine de 78 kDa nécessite des ions calcium à se lier à la membrane ^43. Bien que cette association de la membrane a été largement étudiée en utilisant des liposomess = "référence externe"> ^{44, 45, 46} et des fractions de membrane ^47, ceux – ci ne peuvent pas être utilisées pour une analyse TEM et la détermination de la structure.

La préparation de nanodiscs commence par le mélange MSP avec des lipides remis en suspension dans le cholate détergent de sodium. Après incubation sur de la glace pendant 1 h, le détergent est lentement éliminé du mélange de reconstitution à l'aide d'une résine adsorbante. Ce type de matériel est souvent faite de forme en petites billes de polystyrène. Ils sont relativement hydrophobes et ont une forte préférence pour un détergent de liaison par rapport aux lipides ^48. Après avoir retiré les billes hydrophobes et effectuer une clarification par centrifugation, les nanodiscs sont purifiés par chromatographie d'exclusion stérique (SEC). Les nanodiscs purifiés sont mélangés avec une protéine de membrane monotopique (et cofacteurs possibles) dans un rapport équimolaire (ou plusieurs rapports pour un titrage) et on laisse rEACT (15 min). L'analyse par TEM est effectuée en appliquant ul-quantités d'échantillon sur, grilles revêtues de carbone lueur déchargée puis en effectuant une coloration négative avec NaPT. Le même échantillon à partir de laquelle les aliquotes ont été appliqués aux grilles de MET peut être utilisé pour l'analyse des non-dénaturant ou une électrophorèse sur gel de SDS-PAGE, ainsi que par divers types de mesures d'activité, sans changements majeurs.

Protocol

1. Préparation de Nanodiscs Expression et purification de la protéine d'échafaudage membranaire 8, 35 Exprimer le MSP1E3D1 His-tagged dans le E. coli BL21 (DE3) souche T1R pRARE2 dans des flacons. Préparer une culture de départ pendant la nuit de 50 ml avec un milieu LB additionné de 50 pg / ml de kanamycine à 37 ° C. Diluer la culture starter pendant une nuit dans 2 litres de milieu de bouillon super supplémenté avec 5…

Representative Results

La méthode que nous proposons dépend de la préparation de nanodiscs pour fournir la surface de la membrane pour la liaison protéine-membrane monotopique. Comme il n'y a pas de protéine transmembranaire incorporé dans la bicouche nanodisc lipidique, les nanodiscs sont ici désignés comme «nanodiscs vides» (figure 2A). Ceux – ci ont un poids moléculaire calculé de 256 kDa , pour une composition de deux protéines d'échafaudage et MSP1E3D1 environ 260 mo…

Discussion

La méthode peut être séparée en trois parties: la reconstitution de nanodiscs vides, la préparation de complexes protéine-nanodisc, et la coloration négative pour le TEM de ces complexes. Chaque partie sera traitée séparément en ce qui concerne les limites de la technique, des étapes critiques, et des modifications utiles.

Reconstitution des nanodiscs vides. étapes et les limites critiques dans la production et l'utilisation de nanodiscs.

Pour la pr?…

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid:POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate	500 mM Sodium cholate		Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock	50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl		Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer	20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA		Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8	BN2001	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250	BN2002	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer	50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S	BN2003	Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer	25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS		Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer	0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol		Inhouse receipe
Terrific broth	Tryptone – 12.0g Yeast Extract – 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol – 4 mL		Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium