透過型電子顕微鏡により膜相互作用タンパク質を視覚化し、分析するための方法
Summary
Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.
Abstract
Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.
Introduction
医学研究では、多くの注意が脂質相互作用の様々な関与、内因性または外因性のいずれかの、膜タンパク質に焦点を当てています。脂質相互作用タンパク質を操作するような洗剤、amphipols 1、または小さいタンパク質2などの脂質への代替を選択する、または可溶性および活性タンパク質を保持する膜の代用品を見つけるのいずれかが含まれます。リポ膜代替物は、リポソームおよびナノディスク（ND）3、4を含みます。
ナノディスクは、天然に血液中に発生する高密度リポタンパク質（HDL）のタンパク質部分、アポA-1を操作することによって開発され、ネイティブに近い膜のプラットフォームです。アポA-1は、短い両親媒性αヘリックスの243残基長鎖状であり、無脂質可溶性コンホメーションを持っています。 in vitroでの脂質の存在下で、タンパク質アポA-1の2つのコピーが自発的にhydrを取り囲むように並べ替えるとき脂質二重層のパッチ5のophobicアシル鎖部分。アポA-1の操作されたバージョンは、一般的に、膜足場タンパク質（MSP）と呼ばれ、数は増加し、プラスミドとして、または精製されたタンパク質として市販されています。 6長いか短い7膜足場タンパク質中のアポA-1、結果の繰り返しまたはαヘリックスの欠失を有します。これにより、直径が17ナノメートル〜8 6nmで7の周りにディスクを形成することができます。ナノディスク3,9のためのアプリケーションの種類があります。最も一般的に使用されるアプリケーションは、以前に3,9レビュー内在性膜タンパク質8の安定化のために、ネイティブに近い膜環境を提供することです。あまり探求使用は、研究のためのナノスケールの膜表面を提供することを目的とします周辺膜タンパク質10、11、12、13、14、15、16、17。プロトコルの第1節は、以下のリン脂質や膜骨格タンパク質から構成されるナノディスクを作成するための手順を可視化します。
サンプル調製は、ほとんどのメソッドのボトルネックです。メソッド固有のサンプルは、特定の情報を追加することができ、彼らはまた、結果の比較が困難になります。試料がマルチモーダルであり、いくつかの異なる方法で直接使用することができる場合したがって、簡単です。ナノディスクを用いて一つの利点は、リポソーム（ 例えば、サンプルは直接本プロトコルのように、TEMおよび非変性ゲル電気泳動の両方のために使用することができる）と比較して、ナノディスクの小さいサイズです。
<p class = "jove_content">小胞およびリポソームは、長い膜相互作用タンパク質の機能を理解するために使用されています。構造研究と可視化のために、リポソーム中の膜貫通型タンパク質の構造的決意の例は、18利用可能です。しかし、リポソーム膜に埋め込まれたmonotopic膜タンパク質のない高解像度の3D構造は、我々の知る限りでは、まだ公開されていません。金ナノ粒子または抗体は、TEM 19を用いてリポソームまたは小胞に結合するタンパク質を可視化するために使用することができます。これらのプローブは、非常に特異的であるにもかかわらず、彼らは膜結合部位をベーリングしたり、柔軟な部品で関心のある分野をマスキングすることにより、膜結合タンパク質を妨害する可能性があります。金標識又は抗体複合体を形成するタンパク質は、おそらくゲル上で分析することができ、これは実験のコストを増加させます。リポソームは優れたプラットフォームであるが、一つはポップと確信することはできませんピュレーションは、リポソームあたりのタンパク質の特定の比率、ナノディスク20を使用することによって探索することができるという特徴を持っています。リポソームでは、補因子および基質は可溶性の内部に捕捉することができます。膜溶解性である物質は、膜模倣体の両方のタイプのための同じ運命を共有します。二重層領域がナノディスクに小さくなるようにもかかわらず、物質の少量を、ナノディスクの膜を飽和させるのに必要とされます。
原子構造の決意を介してタンパク質の機能を理解することは、研究の多くの分野のために不可欠となっています。タンパク質構造決意するための方法は、X線21を含みます。核磁気共鳴（NMR）22、23。透過型電子顕微鏡（TEM）極低温で24、cryoEM。 cryoEMによって解像度が最近大幅に主に起因する直接電子デの使用に、改善されました26、25 tectors。巨大分子は、ネイティブに近い状態で薄く、ガラス質氷27に結像されます。 200 kDaの – しかし、生体分子の低コントラストのために、彼らは100のサイズ範囲で検出が困難になります。適切なサイズのサンプルについては、データ収集を行うことができ、単一粒子の再構成の方法は、構造体28を得るために適用することができます。
しかし、TEMによるタンパク質構造の決意は、多段階プロセスです。これは通常phosphotungstenのような重金属の塩を使用して負染色TEM 29（PT）30やウラン31によるサンプル単分散性の評価から始まります。ネガティブ染色高分子の低解像度モデルの再構築は、通常行われ、分子構造29に関する重要な情報をもたらすことができます。並行して、cryoEMを使用してデータ収集を開始してもよいです。アーチファクト形成の誤解を避けるために、ネガティブ染色TEMデータを評価する際には注意が必要です。一つの特定のアーチファクトは、側面33から見たコインのスタックに似た長い棒の形成をもたらし、リン脂質およびリポソーム32にPTの汚れの影響です。 （以下、「スタック」と表記）は、このような「連銭」または「スタック」は、HDL 34早期に観察し、それ以降もナノディスク35のためにしました。
膜の積層と整形は多くの理由で発生することがあります。例えば、モリブデン酸アンモニウム染色36でTEM画像で示される銅のような補因子によって誘導することができます。リポソーム中の膜脂質の割合は、このように銅イオンを添加した後、リポソームを積層し、EDTAによって金属錯体を模倣イミノジ酢酸頭部基を含有しました<sクラス= "外部参照"> 36アップ。スタッキングも（使用ステインが言及されていない）脂質二重層内または上のタンパク質によって37タンパク質間相互作用に起因する可能性があります。 PTによるリン脂質のスタック形成は早い段階で観察されました。しかし、それ以降の作業は、このアーティファクト形成38を削除するか、廃止に焦点を当てています。
ここでは、TEMによる膜結合タンパク質の研究のために積み重ねNAPTによって誘発されるナノディスクを利用する方法を提案します。要するに、ナノディスクに結合タンパク質が積み重ねからナノディスクを防止するであろう。スタッキングの理由は明らかではないが、それはお互いに（ 図1A）に固執するディスクを引き起こし、リン脂質およびPTのホスホリル基との間の静電相互作用があることが39提案されました。私たちのプロトコルの背後にある仮説は、タンパク質は、ナノディスクに結合すると、リン脂質表面の大部分はご利用できないということですタンパク質による立体障害によりPTとの相互作用についてBLE。これは、スタックの形成（ 図1B）を防止するであろう。二つの結論を引き出すことができます。まず、積層の予防は、対象のタンパク質が膜に結合したことを意味します。第二に、タンパク質ND複合体は、複合体の大まかな形態を得るために、標準的な単一粒子処理方法24、40で処理することができます。また、非変性ゲル電気泳動または動的光散乱のような方法によって分析を行うことができます。
この仮説を実証するために、我々は、多くの炎症性疾患41,42に関与する膜結合タンパク質5-リポキシゲナーゼ（5LO）を使用しました。この78-kDaのタンパク質は、その膜43にバインドするためにカルシウムイオンを必要とします。この膜結合は、リポソームを用いて広く研究されているもののS = "外部参照"> 44、45、46、膜画分47、これらは、TEM分析および構造決意するために使用することができません。
ナノディスクの調製は、界面活性剤コール酸ナトリウムに再懸濁脂質とMSPを混合することによって開始されます。 1時間氷上でインキュベートした後、界面活性剤をゆっくりと吸着樹脂を使用して再構成混合物から除去されます。この種の材料は、しばしば小さなビーズに成形ポリスチレンで作られています。彼らは比較的疎水性であり、脂質の48に比べて洗剤を結合するための強力な好みを持っています。疎水性ビーズを除去し、遠心分離を用いて説明を行った後、ナノディスクは、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）により精製します。精製されたナノディスクは、（滴定用またはいくつかの比率）等モル比でmonotopic膜タンパク質（および可能な補因子）と混合されているとrに残っていますEACT（15分）。 TEMによる分析は、グロー放電、炭素被覆グリッド上に試料をμL-量を適用することによって、その後、NAPTでネガティブ染色を行うことによって行われます。アリコートをTEMグリッドに適用した場合の同じサンプルは大きな変化で、非変性またはSDS PAGEゲル電気泳動によって、並びに活性測定の各種による分析のために使用することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
空のナノディスクの再構成、タンパク質ナノディスク複合体の調製、およびこれらの複合体のTEMについて陰性染色：この方法は、3つの部分に分離することができます。各部分は技術の限界、重要なステップ、および有用な修飾に関する個別に対処されることになります。
空のナノディスクの再構成。ナノディスクの製造と使用における重要なステップと制限。
<p class="j…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は彼らのサポートのためにスウェーデンの研究評議会、ストックホルム郡評議会、およびKI資金に感謝します。 MSPの発現および精製は、カロリンスカ研究所/ SciLifeLabタンパク質科学基盤施設（http://PSF.ki.se）で行いました。また、作者は彼らの技術的な専門知識を共有するため、それらのタイムリーな支援のために博士パシPurhonen博士マチルダスエルバーグに感謝したいと思います。
Materials
| Transmission electron microscope: JEOL2100F | JEOL | ||
| CCD camera | Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany | ||
| Glow discharger | Baltec | ||
| TEM grid: 400 mesh | TAAB | GM016/C | |
| Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5 | Agilent Technologies | 5190-2526 | |
| Superdex 200 HR 10/300 | GE Healthcare Life Sciences | 17-5172-01 | |
| Plasmid:MSP1E3D1 | Addgene | 20066 | |
| Bacteria: BL21DE3 | NEB | C2527H | |
| Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2 | Protein Science Facility, KI, Solna | ||
| Purification Matrix: ATP agarose | Sigma Aldrich | A2767 | |
| Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml | GE Healthcare Life Sciences | 17-5247-01 | |
| Lipid:POPC | Avanti polar lipids | 850457C | 25 mg/ml in chloroform |
| Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin | Bio-Rad | 1523920 | |
| 13 mm syringe filter: 0.2 μm | Pall life sciences | PN 4554T | |
| Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate | Sigma Aldrich | 31648 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148-250ML | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0301 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | |
| TCEP | Sigma Aldrich | 646547 | |
| Detergent: Sodium cholate hydrate | Sigma Aldrich | C6445-10G | |
| Sodium Cholate | 500 mM Sodium cholate | Resuspend in miliQ water and store at -20°C | |
| Lipid Stock | 50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl | Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen |
|
| MSP standard buffer | 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA | Store at 4°C | |
| Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer | 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 | BN2001 | Purchased from Thermofisher Scientific |
| Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer | 50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250 | BN2002 | Purchased from Thermofisher Scientific |
| Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer | 50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S | BN2003 | Purchased from Thermofisher Scientific |
| Denaturaing Electrophoresis Running Buffer | 25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS | Inhouse receipe | |
| Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer | 0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol | Inhouse receipe | |
| Terrific broth | Tryptone – 12.0g Yeast Extract – 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol – 4 mL |
Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium |
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