Método para visualizar y analizar de membrana Interactuando Proteínas por Microscopía Electrónica de Transmisión

Summary

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Abstract

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca²⁺-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Introduction

En la investigación médica, mucha atención se centra en proteínas de membrana, ya sea intrínsecos o extrínsecos, que participan en una variedad de interacciones de lípidos. Trabajando con proteínas lípidos interactuar incluye o bien la selección de un sustituto a los lípidos, tales como detergentes, amphipols ^1, o proteínas pequeñas ^2, o la búsqueda de un sustituto de la membrana que mantiene la proteína soluble y activa. Sustitutos de membrana lipoico incluyen liposomas y nanodiscos (ND) ^{3, 4.}

Nanodiscos son plataformas de membrana cerca de nativos desarrollados por la ingeniería de la parte proteica, ApoA-1, de la lipoproteína de alta densidad (HDL) de origen natural en la sangre. ApoA-1 es una cadena de 243 residuos de longitud de cortos alfa-hélices anfipáticas y tiene una conformación soluble en lípidos libres. In vitro cuando en la presencia de lípidos, dos copias de la proteína ApoA-1 reordenan espontáneamente para rodear la hidrporción de la cadena de acilo ophobic de un parche bicapa lipídica ^5. versiones de ingeniería de ApoA-1 generalmente se llaman proteínas de andamiaje de membrana (MSP), y un número creciente están disponibles comercialmente como plásmidos o como proteínas purificadas. Repeticiones o deleciones de los alfa-hélices de la ApoA-1 resultado en andamios proteínas de membrana ^{7 6} más largos o más cortos. Esto a su vez hace que sea posible formar discos de alrededor de 6 nm ^7-17 nm ⁸ de diámetro. Hay diferentes tipos de aplicaciones para el nanodiscos ^{3, 9.} La aplicación más utilizada es el de proporcionar un entorno de membrana casi nativo para la estabilización de una proteína de membrana ^8, previamente revisados ^{3, 9.} Un uso menos explorada-es proporcionar una superficie de membrana nanoescala para el estudio demembrana periférica proteínas ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17.} Sección 1 del protocolo a continuación visualiza el procedimiento para hacer nanodiscos compuestas de fosfolípidos y proteínas de andamiaje membrana.

Preparación de la muestra es un cuello de botella en la mayoría de los métodos. muestras específicas del método pueden añadir información en particular, pero también hacer comparaciones de los resultados difícil. Por lo tanto, es más simple cuando las muestras son multimodal y se pueden utilizar directamente en varios métodos diferentes. Una de las ventajas con el uso de nanodiscos es el pequeño tamaño de la nanodisc en comparación con liposomas (por ejemplo, las muestras se pueden utilizar directamente para ambos TEM y electroforesis en gel no desnaturalizante, como en el presente Protocolo).

<p class = "jove_content"> Las vesículas y liposomas han sido utilizados para comprender la función de la membrana de proteínas que interactúan. Para los estudios estructurales y de visualización, un ejemplo de la determinación estructural de una proteína transmembrana en liposomas está disponible ^18. Sin embargo, ninguna estructura 3D de alta resolución de una proteína de membrana monotópico incrustado en una membrana del liposoma se ha publicado todavía, en lo que sabemos. Nanopartículas o anticuerpos oro puede ser utilizado para visualizar las proteínas de unión a liposomas o vesículas utilizando TEM ^19. A pesar de que estas sondas son muy específicos, que podrían interferir con las proteínas de unión a la membrana por el velo del sitio de unión de membrana o por áreas de interés con las partes flexibles de enmascaramiento. Marcado con oro o proteínas de anticuerpo complejado probablemente podría ser analizado en un gel, pero esto aumentaría el costo del experimento.

Aunque los liposomas son una excelente plataforma, no se puede estar seguro de que el populación tiene una relación particular de proteína por liposoma, una característica que puede ser explorado por el uso de nanodiscos ^20. En un liposoma, cofactores y sustratos pueden ser atrapados en el interior soluble. Las sustancias que son solubles en la membrana compartirán el mismo destino para ambos tipos de miméticos de membrana. Sin embargo, como la zona de dos capas es más pequeño en nanodiscos, se requiere una menor cantidad de sustancia para saturar las membranas nanodisc.

función de las proteínas comprensión a través de la determinación de la estructura atómica ha sido esencial para muchos campos de investigación. Los métodos para la determinación de la estructura de proteínas incluyen rayos-X ^21; resonancia magnética nuclear (NMR) ^{22, 23;} y microscopía electrónica de transmisión (TEM) ²⁴ a temperaturas criogénicas, cryoEM. La resolución por cryoEM últimamente se ha mejorado en gran medida, debido principalmente a la utilización de electrones de directadetectores ^{25, 26.} Las macromoléculas son imágenes en, hielo vítreo delgada ²⁷ en un estado casi nativo. Sin embargo, debido al bajo contraste de las moléculas biológicas, se convierten en difíciles de detectar en el rango de tamaño de 100 a 200 kDa. Para muestras de tamaño adecuado, la recogida de datos se puede realizar y el método de reconstrucción de partícula única se puede aplicar para obtener una estructura ^28.

Sin embargo, la determinación de la estructura de la proteína por TEM es un proceso de múltiples pasos. Por lo general comienza con la evaluación de monodispersividad muestra mediante tinción negativa TEM ²⁹ utilizando sales de metales pesados como el phosphotungsten (PT) ^{30 31} o uranio. La reconstrucción de un modelo de baja resolución de la macromolécula con tinción negativa se hace generalmente y puede proporcionar información importante sobre la estructura molecular ^29. En paralelo,Recopilación de datos mediante cryoEM puede comenzar. Se debe tener cuidado al evaluar los datos de TEM de tinción negativa para evitar la mala interpretación de formación de artefactos. Un artefacto en particular es el efecto de la mancha PT en fosfolípidos y liposomas ^32, lo que resulta en la formación de varillas largas se asemejan a las pilas de monedas, vista desde el lado ^33. Tal "cartucho de dinero" o "pilas" (de aquí en adelante designado como "pilas") se observaron desde el principio para el HDL ^{de 34 años,} y más tarde también para nanodiscos ^35.

El apilamiento y la reorganización de las membranas pueden ocurrir por muchas razones. Por ejemplo, puede ser inducida por co-factores como el cobre, que se muestran por imágenes TEM en una mancha de molibdato de amonio ^36. Una fracción de los lípidos de membrana en liposomas contenía un grupo de cabeza de ácido iminodiacético imitando la formación de complejos de metal por EDTA, apilando de este modo los liposomas después de la adición de iones de cobre <shasta class = "xref"> 36. Stacking también podría ser debido a una interacción proteína-proteína por una proteína en o sobre las bicapas lipídicas (la mancha utilizado no se menciona) ^37. Se observó temprano en la formación de pila de fosfolípidos por PT; Sin embargo, el trabajo posterior se ha centrado en la eliminación o supresión de esta formación artefacto ^38.

En este caso, se propone un método para tomar ventaja de la nanodisc inducida por NAPT apilamiento para el estudio de las proteínas de unión a la membrana por TEM. En resumen, la unión de las proteínas nanodiscos impediría que los nanodiscos de apilamiento. Aunque las razones para el apilamiento no son claros, se propuso ³⁹ que hay una interacción electrostática entre los fosfolípidos y el grupo fosforilo de PT, haciendo que los discos a pegarse entre sí (Figura 1A). La hipótesis detrás de nuestro protocolo es que cuando una proteína se une a una nanodisc, la mayor parte de la superficie de fosfolípido no es availa ble para la interacción con el PT debido a impedimento estérico por la proteína. Esto evitaría la formación de la pila (Figura 1B). Dos conclusiones pueden extraerse. En primer lugar, la prevención de apilamiento significa que la proteína de interés se ha unido a la membrana. En segundo lugar, el complejo proteína-ND se puede tratar con los métodos de procesamiento de una sola partícula estándar ^{24, 40} para obtener una morfología rugosa del complejo. Por otra parte, los análisis mediante métodos como la electroforesis en gel no desnaturalizante o dispersión de luz dinámica se puede realizar.

Para demostrar esta hipótesis, se utilizó la proteína de unión a membrana de 5-lipoxigenasa (5LO), que está implicado en muchas enfermedades inflamatorias ^{41, 42.} Esta proteína de 78 kDa requiere iones de calcio para unirse a su membrana ^43. Aunque esta asociación a la membrana se ha estudiado ampliamente el uso de liposomass = "xref"> ^{44, 45, 46} y las fracciones de membrana ^47, éstas no se pueden utilizar para el análisis de TEM y determinación de la estructura.

La preparación de nanodiscos comienza mezclando MSP con lípidos se resuspendieron en el colato de sodio detergente. Después de la incubación en hielo durante 1 h, el detergente se retira lentamente de la mezcla de la reconstitución utilizando una resina adsorbente. Este tipo de material se hizo con frecuencia de forma en pequeñas perlas de poliestireno. Son relativamente hidrófobo y tienen una fuerte preferencia por la unión de detergente en comparación con los lípidos ^48. Después de retirar las perlas hidrófobas y la realización de la clarificación mediante centrifugación, las nanodiscos se purifican por cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). Los nanodiscos purificados se mezclaron con una proteína de membrana monotópico (y posibles cofactores) en una relación equimolar (o varias relaciones de valoración) y se dejan a react (15 min). El análisis por TEM se lleva a cabo mediante la aplicación de mu L-cantidades de muestra sobre, rejillas revestidas de carbono resplandor descargada y luego mediante la realización de tinción negativa con NAPT. La misma muestra de cuando las alícuotas se aplicaron a las rejillas TEM se puede utilizar para el análisis por no desnaturalizante o PAGE SDS-electroforesis en gel, así como por varios tipos de mediciones de la actividad, sin cambios importantes.

Protocol

1. Preparación de nanodiscos Expresión y purificación de la proteína de andamiaje de la membrana 8, 35 Expresar el MSP1E3D1 marcada con His en el E. coli BL21 (DE3) cepa T1R pRARE2 en frascos. Preparar un cultivo iniciador durante la noche de 50 ml con medio LB suplementado con 50 g / ml de kanamicina a 37 ° C. Diluir el cultivo iniciador durante la noche en 2 L de medio de caldo excelente suplementado con 50 g / ml de kanamicin…

Representative Results

El método que proponemos depende de la preparación de nanodiscos para proporcionar la superficie de la membrana para la unión monotópico membrana-proteína. Como no existe una proteína transmembrana incrustado en la bicapa lipídica nanodisc, los nanodiscos están aquí denotan como "nanodiscos vacías" (Figura 2A). Estos tienen un peso molecular calculado de 256 kDa para una composición de dos proteínas MSP1E3D1 andamios y alrededor de 260 moléculas de…

Discussion

El método se puede separar en tres partes: la reconstitución de nanodiscos vacíos, la preparación de complejos de proteína-nanodisc, y de la tinción negativa para el TEM de estos complejos. Cada parte se trata de forma independiente con respecto a las limitaciones de la técnica, los pasos críticos, y las modificaciones útiles.

La reconstitución de nanodiscos vacías. Los pasos críticos y limitaciones en la producción y uso de nanodiscos.

Para la preparac…

Materials

Transmission electron microscope: JEOL2100F	JEOL
CCD camera	Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Germany
Glow discharger	Baltec
TEM grid: 400 mesh	TAAB	GM016/C
Size exclusion chromatography: Agilent SEC-5	Agilent Technologies	5190-2526
Superdex 200 HR 10/300	GE Healthcare Life Sciences	17-5172-01
Plasmid:MSP1E3D1	Addgene	20066
Bacteria: BL21DE3	NEB	C2527H
Bacteria: BL21 (DE3) T1R pRARE2	Protein Science Facility, KI, Solna
Purification Matrix: ATP agarose	Sigma Aldrich	A2767
Purification Matrix: HisTrap HP-5 ml	GE Healthcare Life Sciences	17-5247-01
Lipid:POPC	Avanti polar lipids	850457C	25 mg/ml in chloroform
Hydrophobic beads: Bio-Beads, SM-2 Resin	Bio-Rad	1523920
13 mm syringe filter: 0.2 μm	Pall life sciences	PN 4554T
Stain: Sodium phosphotungstate tribasic hydrate	Sigma Aldrich	31648
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148-250ML
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	Bio-Rad	161-0301
Protease inhibitor cocktail	Sigma Aldrich	4693132001
TCEP	Sigma Aldrich	646547
Detergent: Sodium cholate hydrate	Sigma Aldrich	C6445-10G
Sodium Cholate	500 mM Sodium cholate		Resuspend in miliQ water and store at -20°C
Lipid Stock	50 mM POPC, 100 mM sodium cholate, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl		Store at 4°C for a week or Store -80°C for a month, after purging the solution with nitrogen
MSP standard buffer	20 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5 mMEDTA		Store at 4°C
Non-Denaturaing Electrophoresis Anode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8	BN2001	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis Cathode Buffer	50 mM Bis Tris 50 mM Tricine, pH 6.8 0.002% Coomassie G-250	BN2002	Purchased from Thermofisher Scientific
Non-Denaturaing Electrophoresis 4X Sample loading Buffer	50 mM BisTrispH 7.2, 6N HCl, 50 mM NaCl, 10% (w/v) glycerol, 0.001% Ponceau S	BN2003	Purchased from Thermofisher Scientific
Denaturaing Electrophoresis Running Buffer	25 mM Tris-HCl pH 6.8, 200 mM Glycine, 0.1 % (w/v) SDS		Inhouse receipe
Denaturaing Electrophoresis 5X Sample loading Buffer	0.05 % (w/v) Bromophenolblue, 0.2 M Tris-HCl pH 6.8, 20 % (v/v) glycerol, 10% (w/v) SDS,10 mM 2-mercaptoethanol		Inhouse receipe
Terrific broth	Tryptone – 12.0g Yeast Extract – 24.0g 100 mL 0.17M KH2PO4 and 0.72M K2HPO4 Glycerol – 4 mL		Tryptone, yeast extract and glycerol were prepared to 900 ml and autoclaved seperately. KH2PO4 and K2HPO4 were prepared and autoclaved separately. Both were mixed before using the medium