Unravelling funktionen av en bakteriell Effector från en icke-odlingsbar växtpatogen hjälp av en jäst två-hybrid Screen

Summary

Bakteriella effektor proteiner är viktiga för att etablera framgångsrika infektioner. Detta protokoll beskriver den experimentella identifiering av proteinbindningspartner av en bakterie effektor protein i dess naturliga växtvärd. Identifiera dessa effektorceller interaktioner via jäst två-hybridskärmar har blivit ett viktigt verktyg i unraveling molekylära patogenicitet strategier.

Abstract

Unravelling de molekylära mekanismerna för sjukdomsmanifestationer är viktigt att förstå sjukdomar och symptom utveckling inom växtvetenskap. Bakterier har utvecklats olika strategier för att manipulera sin värd metabolism för egen vinning. Denna bakterie manipulation är ofta kopplade till svår symptomutveckling eller död av de påverkade växter. Fastställa de specifika bakteriella molekyler som är ansvariga för värd manipulation har blivit ett viktigt område i mikrobiologisk forskning. Efter identifiering av dessa bakterie molekyler, som kallas "effektorer", är det viktigt att belysa deras funktion. En enkel metod för att bestämma funktionen av en effektor är att identifiera dess proteinhaltigt bindningspartner i sin naturliga värd via en jäst två-hybrid (Y2H) skärm. Normalt värd hyser många potentiella bindningspartner som inte kan förutsägas tillräckligt av någon in silico algoritm. Det är därför det bästa valet för att perform en skärm med den hypotetiska effektor mot ett helt bibliotek av uttryckta värdproteiner. Det är särskilt utmanande om det orsakande medlet är uncultivable som phytoplasma. Detta protokoll ger steg-för-steg-instruktioner för DNA-rening från en phytoplasma-infekterade woody värdväxt, förstärkningen av den potentiella effektor och efterföljande identifiering av anläggningens molekylär interaktion partner med en Y2H skärm. Även om Y2H skärmar används ofta, finns det en tendens att lägga ut denna teknik till bioteknikföretag som erbjuder Y2H service till en kostnad. Detta protokoll ger instruktioner om hur du utför en Y2H i något anständigt utrustade molekylärbiologiskt laboratorium med användning av standardlaboratorietekniker.

Introduction

Jäst två-hybrid skärmar (Y2H) utvecklades ungefär 27 år sedan ^ett och har sedan använts i stor utsträckning inom olika områden för att fastställa specifika protein-proteininteraktioner ^{2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11} . Den fysiska interaktionen av en bakterie effektor med en mängd målprotein är ofta en förutsättning för den funktionella manipulering av detta målprotein. Analysera dessa interaktioner har flyttats till fokus för många olika sektorer av infektionsbiologi ^{12, 13, 14, 15,}"> ^{16, 17, 18.} Principen för Y2H skärmen är att interaktionen av två proteiner leder till rekonstituering av en funktionell transkriptionsfaktor som driver uttrycket av reportergener. Den kända effektor (" bete ") har translation fuserad till den DNA-bindande domänen (DBD) av transkriptionsfaktorn, och den potentiella interaktionen partners (den "byte") är sammansmälta med aktiveringsdomänen (AD) hos respektive transkriptionsfaktorn. Eftersom den samverkande partner är okänd, ett bibliotek av potentiella interactmedlemmar klonas i den så kallade "byte-bibliotek." normalt är detta bibliotek görs genom kloning cDNA i en lämplig byte vektor expressionsplasmid som kodar för AD som är kompatibel med betet vektor kodad DBD. vid en interaktion, ombildade transkriptionsfaktorer inducera uttryck av reportergener, som i allmänhet gör det möjligt för tillväxt valet av jäst. denidentifiering av Interactmedlemmar uppnås genom sekvensering av bytet plasmiden med plasmid-specifika primrar.

Bakterier har utvecklat olika strategier för att manipulera och utnyttja sina värdens metabolism eller att undgå försvarsmekanismer och utsöndrar effektormolekyler via olika bakteriesekretionssystem ^{19, 20, 21.} Bestämning av de bindningspartners av dessa bakterie effektorer är sålunda det första steget i att identifiera den manipulerade reaktionsvägen i värden. Detta leder till en bättre förståelse av de specifika patogenicitet mekanismer.

Y2H skärmar utförs för att identifiera bakterie effektor interaktioner under phytoplasmoses, och ofta är Y2H en avgörande inledande experiment för ytterligare karakterisering av molekylära patogenicitet mekanismer phytoplasma forskning ^{22, 23.} Emellertid den träffadehod beskrivning i de flesta publikationer är ganska sällsynt, och dessa tekniker är ofta outsourcad till bioteknikföretag. För att uppmärksamma möjligheten att denna metod ger detta protokoll steg-för-steg-information för att identifiera interaktionspartner en bakteriell effektormolekyl i sin naturliga värd.

Trots den utbredda användningen och snabbspolning framåt tillvägagångssätt Y2H skärmar, får man inte glömma att vissa interaktioner inte kan förekomma i jästsystemet. Detta beror på det faktum att jästcellen används som ett slags "in vivo reaktionskärl" med vissa biologiska begränsningar. Flera författare har tagit upp för- och nackdelar med Y2H och dess derivat ^{11, 24, 25, 26, 27.} Allmänna överväganden är till exempel, att jästcellen inte kan åstadkomma den lämpligagenuttryck, (post-) translationell eller translocational betingelserna för respektive proteiner som studeras. Detta kan leda till falskt negativa resultat på skärmen. Positiva interaktioner kan i sin tur vara föremål och kanske inte förekommer i den naturliga situationen (dvs. i fallet med effektenheter i lämplig värd). Det är således nödvändigt att bekräfta de interaktioner från den heterologa jästexpressionssystem med en oberoende interaktionstestet på ett mer nära besläktade biologiskt system.

I denna studie var de bindande partners till effektor ATP_00189 från den icke-odlingsbara växtpatogen Candidatus Phytoplasma mali (P. mali) identifieras. Resultaten ger viktiga insikter i de molekylära mekanismer som ligger bakom symptom utvecklingen av Apple proliferation ^28, en sjukdom som orsakar höga ekonomiska förluster i drabbade äppelodlings regioner i Europa ^29.

Protocol

1. Samla Root och bladprover från infekterade äppelträd Notera: Pathogen-specifik DNA kan renas från rötter eller blad. Följande avsnitt ger ett protokoll för provtagning av båda. För DNA-beredning Provtagning och förberedelse från rötterna Identifiera infekterade träd med "Apple proliferation" specifika symtom 30, 31 och styr träd som är symtomfria. Med användning av rena sekatörer, skär rotprover som har en diameter av 0,5 – 1 cm och en längd av ca 5 cm. Cut prover från tre olika, avlägsna platser i rotsystemet, och sätta dem i korrekt märkta plastpåsar. Hålla proverna i en kall låda med kylda termiska paket och lagra dem i kylskåpet vid 4 ° C tills vidare bearbetning. Notera: Root arkitektur och struktur kan variera med avseende på den fysiologiska status of trädet. Det är viktigt att ta prov på tre olika platser och inte att ta alltför tunna rottrådar. Proven kan lagras under flera dagar vid 4 ° C, men längre lagringstider öka risken för formning. Mögliga prover kan inte användas för DNA-beredning. Skölj rotprover med vatten för avlägsnande av jord. Lägg dem i en steril petriskål och använda en steriliserad skalpell för att avlägsna de bakomliggande överhuden och cortex. Rengör skalpellen med en ren, luddfri trasa torka, doppa den i 70% (v / v) etanol vattenlösning, och värme sterilisera den över en öppen eld (t.ex. bunsenbrännare). Skrapa floem med skalpell, hacka den i små bitar, och delprov 30 – 100 mg av hackade floem i en steril 2,0 ml reaktionsrör. Lagra proverna vid -80 ° C under flera månader. Provtagning och förberedelse från blad Identifiera en infekterad och en asymtomatisk kontrollträd, ens beskrivs i steg 1.1.1.1, och plocka tio oskadd blad per träd. Ett träd per tillstånd är tillräckligt. Skölj bladen med vatten och rengör ytorna genom sprutning 70% (vol / vol) etanollösning. Sätta bladen i en steril petriskål och dissekera NERV (central ven) av varje blad med en steril skalpell. Ta bort överhuden och cortex från Mittnerven, skär Mittnerven i små bitar, och delprov 100 mg av Mittnerven vävnaden i en steril 2,0 ml reaktionsrör. Använda proverna omedelbart för DNA-beredning eller förvara vid -80 ° C under flera månader. Obs: Det är praktiskt att Alikvotera växtmaterial i portioner om 100 mg och slutligen frysa dem för förvaring. Varje alikvot kan direkt användas för DNA-beredning. Vägning djupfryst växtmaterial är besvärligt, eftersom det frusna växtmaterialet tenderar att bilda klumpar. 2. cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB) -baserade DNA-framställning <p class = "jove_content"> Anmärkning: DNA kan renas med användning av någon kolumnbaserad DNA-reningsmetod för växtmaterial. I detta avsnitt, är en CTAB-baserad metod för DNA-rening som beskrivits. DNA-rening utförs baserat på ett modifierat protokoll som beskrivs på annan plats 32. Förbered följande buffertar: CTAB-buffert: Lös 1% vikt / volym cetyltrimetylammoniumbromid (CTAB, M r: 364,45 g / mol), 100 mM trishydroximetylaminometan (Tris, M r: 121,14 g / ml), 1,4 M natriumklorid (NaCl, M r: 58,44 g / mol), och 20 mM etylendiamintetraättiksyra-dinatriumsalt (NaEDTA, M r: 372,24 g / mol) i vatten och justera dem till pH 8,0. N-lauroylsarkosin buffert: Lös 10% vikt / volym N-lauroylsarkosin natriumsalt 33 (M r: 293,38 g / mol), 100 mM Tris, och 20 mM NaEDTA i vatten och justera pH till 8,0. Tris-EDTA (TE) buffert: Lös 10 mM Tris och 1 mM NaEDTA i vatten och autoclave lösningen. Ammoniumacetatlösning: Bered en 5 M ammoniumacetat (M r: 77,0825 g / mol) lösning i vatten och autoklavera den vid 120 ° C och 1,2 bar under 20 min. Blanda 30 – 100 mg av färskt eller fryst hackade växtmaterial (steg 1.1.2.2.) Med 300 mikroliter av CTAB-buffert, 30 | il av N-lauroylsarkosin-buffert, 6 | il av proteinas K (10 pg / pL), och 12 mikroliter av 2-merkaptoetanol 34 (M r: 78,13 g / mol). Skaka i 60 minuter vid 60 ° C. Låt blandningen svalna till rumstemperatur innan du fortsätter. Lägg 360 mikroliter av ammoniumacetatlösning och blandas kraftigt. Låt lösningen stå under 5 min, och sedan centrifugera den vid 15.000 xg under 10 min vid rumstemperatur. Överför supernatanten till en ren flaska och tillsätt 720 mikroliter av iskall isopropanol 35. Fälla ut DNA: t i minst 30 min vid -20 ° C. Centrifugera blandningen vid 15.000 xg under 30 min vid 4° C och kassera supernatanten. Tvätta pelleten med 500 mikroliter av iskall 70% etanol och snurra det ned vid 15000 xg under 5 min vid 4 ° C. Kasta etanol supernatanten och omedelbart doppa flaskan på en ren pappershandduk för att avlägsna kvarvarande droppar. Se till att ta bort så mycket vätska som möjligt. Lufttorka pelleten för 15-20 min eller i 2-3 min i en vakuumkoncentrator centrifug. Inte över torka pelleten genom överskott uppvärmning eller utökade avdunstning gånger. Återsuspendera pelleten i 700 | il TE-buffert och slutligen värma upp det till 37 ° C för att underlätta upplösningen. Tillsätt 10 mikroliter av RNAs (10 pg / pL) och inkubera det i 15 min vid 37 ° C, skakning vid 300 rpm. Lägga 700 mikroliter av kloroform: isoamylalkohol 36 24: 1 och blanda väl. Centrifugera blandningen vid 20.000 xg under 10 min vid 4 ° C och överföra den övre fasen av supernatanten till en ny, ren ampull. Fälla ut DNA: t i supematanten genom tillsats av700 mikroliter av 2-propanol 35 (isopropanol, M r: 60,1 g / mol) och inkubation under minst 30 minuter vid -20 ° C. Centrifugera blandningen vid 12.000 xg under 30 min vid 4 ° C och kasta bort supernatanten. Tvätta pelleten med 500 mikroliter av 70% etanol och centrifugera vid 12.000 xg under 5 min vid 4 ° C. Torka pelleten såsom beskrivs i steg 2,5. Lösa upp den i 50 | il TE. 3. Detektion Candidatus Phytoplasma mali-specifik DNA genom PCR Späd DNA renas från växtmaterial 1:10 i nukleasfritt vatten och köra en PCR med patogenspecifika primrar 37. Verifiera närvaron av P. mali-specifik DNA i växtmaterialet genom användning av en kvantitativ PCR-protokoll med primers och specifika prober för P. mali phytoplasma 37. Kontrollera frånvaron av de andra 16SrX phytoplasma medlemmar genom att utföra samma PCR med respektive prober för Cand. P. prunorum och Cand. P. pyri DNA 37. OBS: DNA från en icke-infekterade träd bör testas samt för att bekräfta frånvaron av en patogen i denna kontroll. I detta steg är det viktigt att DNA från andra närbesläktade phytoplasma arter är frånvarande i provet, eftersom det skulle öka risken för att förstärka effektorn från en annan art än P. mali phytoplasma arter. En blandad infektion med en annan närbesläktad P. Mali 16SrX grupp phytoplasma är utesluten genom att analysera provet med respektive sönder. Eftersom de förväntade resultaten bör vara negativ för andra 16SrX phytoplasma, är det viktigt att inkludera rätt positiva kontroller som visar PCR effekt. 4. amplifiera de Potential Effector Gen och Subkloning in i Y2H Bete vektor Förstärka phytoplasmal genen atp_00189 (inte innefattande signalpeptiden del) av P. Mali använder primers 5-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA-3 (framåt) och 5-TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT-3 (omvänt), med restriktionsställen för EcoRI och Sall vid 5'- och 3'-ändarna, respektive. Rena PCR-produkten med en kolonn-baserad DNA-reningsmetod. Klona amplikon i Y2H bete vektor pLexA-N via EcoRI och Sall ligering. OBS: Här, 100 ng EcoRI och Sall linjäriserad pLexA-N vektor kombinerades med 15 ng av på samma sätt kluven atp_00189 PCR amplikon och en U T4-ligas. Ligeringen utfördes i buffert innehållande 40 mM Tris-HCl (pH 7,9 vid 25 ° C), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol (DTT, M r: 154,25 g / mol) och 0,5 mM adenosintrifosfat (ATP, M r: 507,18 g / mol) i en total volym av 10,0 | il vid 16 ° C över natten (14-20 h). Analysera DNA från oinfekterade trädet med samma primers för att utesluta ospecifik primer binder till Malus x domestica </Em> DNA. Transformera en mikroliter av ligeringsblandningen in i E. coli-elektrokompetenta celler och selektera för kanamycinresistenta kloner på Luria-Bertani (LB) plattor som kompletterats med 50 mikrogram / ml kanamycinsulfat 38. Rena plasmid DNA från de utvalda bakteriekloner med en kolonn-baserad plasmid mini förberedande kit enligt tillverkarens instruktioner och kontrollera en framgångsrik integration och orientering av insatsen genom sekvensering 39. 5. test för självaktivering (automatisk aktivering) av möjligheterna Effector Protein Förbered följande buffertar och odlingsmedier: OBS: Den nomenklatur för jäst-selektiva plattor hyphenates förkortningarna av de saknade aminosyrorna i respektive medium med en "-" före förkortningen. Till exempel, SD-trp-Leu-hans plattor innehåller alla aminosyror men trp, Leu och hans. 10x dropout mix: Väg200 mg L-arginin-monohydroklorid (M r: 210,66 g / mol), 300 mg L-isoleucin (M r: 131,17 g / mol), 269 mg L-lysin-monohydrat (M r: 164,21 g / mol), 200 mg L-metionin (M r: 149,21 g / mol), 500 mg L-fenylalanin (M r: 165,19 g / mol), 2 g L-treonin (M r: 119,12 g / mol), 300 mg av L-tyrosin (Mr: 181,19 g / mol), 200 mg L-uracil (112,09 g / mol) och 1,5 g L-valin (M r: 117,15 g / mol). Upplösa dem i ett L för dubbeldestillerat vatten och autoklavera lösningen. Hålla lösningen vid 4 ° C. OBS: Respektive dropout mix kan vara köpte också förblandas. 10x L-adenin tillägg: Väg 100 mg L-adenin hemisulfatsalt (ade, M r: 184,17 g / mol) och lös det i 50 ml dubbeldestillerat vatten. Filtersterilisera lösningen med en 0,22-um porfilter. 10x L-histidin tillägg: Väg 100 mg L-histidinmonohydrokloridmonohydrat (hans, Mr </sub>: 209,63 g / mol) i 50 ml dubbeldestillerat vatten och filtersterilisera den med en 0,22-um porfilter. 10x L-leucin Tillägg: Väg upp 500 mg av L-leucin (leu, M r: 113,17 g / mol) i 50 ml dubbeldestillerat vatten och filtersterilisera den med en 0,22-um porfilter. 10x L-tryptofan Tillägg: Väg upp 100 mg av L-tryptofan (trp, M ^: 204,23 g / mol) i 50 ml dubbeldestillerat vatten och filtersterilisera den med en 0,22-um porfilter. SD-trp-leu-his-ade-medium och plattor: Lös 0,67% vikt / volym jästkvävebas (utan aminosyror) och 2% vikt / volym D-glukosmonohydrat (M r: 198,17 g / mol) i dubbel- destillerat vatten och autoklav. För agarplattor, tillsätt 2% vikt / vol agar (mikrobiologisk kvalitet) före autoklavering. För att framställa selektiva plattor, till 1x av aminosyrastamlösning till det autoklave Sd-trp-leu-his-ade mediet. Vid framställning av plattor, se till att agar kyls till ~ 50 ° C före tillsatsaminosyrorna. Håll stamlösningarna steril. YPAD-medium: Lös 1% vikt / volym jästextrakt, 2% vikt / volym pepton (mikrobiologisk kvalitet), 0,004% vikt / volym adenin hemisulfatsalt (M r: 184,17 g / mol) och 2% vikt / vol glukos-monohydrat till dubbeldestillerat vatten och autoklav. För YPAD agarplattor, tillsätt 2% vikt / volym agar före autoklavering. För att förbereda 2x YPAD använder dubbelt koncentrationerna av ingredienserna som nämnts ovan. Obs: (tillval) På grund av den höga koncentrationen av glukos i mediet blir 2x YPAD medelmörkbrun efter autoklavering. Som ett alternativ, en 40% (vikt / volym) glukos stamlösning kan framställas och steriliseras genom att passera den genom ett 0,22-pm filter. Filtersteriliserad glukosförrådslösning tillsätts sedan till den autoklaverade 2x YPAD (som saknar glukos) under sterila betingelser. För att undvika volym fel, måste 2x YPAD framställas, med tanke på att en 10x glukoslösning tillsätts därefter. Det betyder att, till exempel, i stället för en L of-medium, är endast 900 ml beredd (som innehåller alla ingredienser utom glukos) och autoklaverades, och sedan 100 ml av glukosförrådslösning tillsätts. Litiumacetat-medierad jästtransformation för testning självaktivering Streak Saccharomyces cerevisiae reporter stam NMY51 40 (NMY51: MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2: :( LexAOp) 4-HIS3 URA3: :( LexAOp) 8-lacZ ade2: :( LexAOp) 8-ADE2 GAL4) från en fryst glycerolstam på en YPAD agarplatta och inkubera det i 48 timmar vid 30 ° C. Plocka kolonier från denna platta och ympa 50 ml av YPAD medium. Låt jästen växa och mäta OD 600 regelbundet för att följa tillväxten. Låt jästen växa till en slutlig OD 600 av 0,5-0,8. Pellets cellerna genom centrifugering dem vid 700 xg under 5 min och återsuspendera dem i 2,5 ml dubbeldestillerat, autoklaverat vatten. Förbered sex portioner med 100 mikroliter av jästsuspension och tillsätt 240 mikroliter av 50% Vikt / volym polyetylenglykol 4000 (PEG, Mj: 3,500-4,000 g / mol), 36 | il av 1 M litiumacetat-dihydrat (LiOAc, M r: 102,02 g / mol) och 25 mikroliter av 2% vikt / volym laxsperma-DNA (upplöst). Förbered alla reagenser med dubbeldestillerat, sterilt vatten. Märk sex flaskor innehållande jästsuspensionen från "a" till "f" och lägg till följande plasmidvektorn DNA: negativa kontroller: (a) 1,5 mikrogram av bete plasmid med effektorn (pLexA-N-atp00189 28), (b) 1,5 | j, g av tomma rov plasmid pGAD-HA 41, (c) 1,5 pg av tomma bete vektor pLexA-N 41 och (d) 1,5 | j, g av tomma bete vektor pLexA-N och 1,5 | j, g av tomma rov plasmid pGAD-HA; positiva kontroller (e) 1,5 pg av positiv kontroll bete plasmid DNA pLexA-p53 41 och 1,5 mikrogram av positiv-byte plasmid pACT-larget 41; och självaktivering test: (f) 1,5 ^ g av baden plasmid med effektorn (pLexA-N-atp00189) och 1,5 mikrogram av tomma byte plasmid pGAD-HA. Blanda reaktionerna kraftigt och inkubera dem i 45 min vid 42 ° C i ett vattenbad. Pellets cellerna under 5 minuter vid 700 xg och kassera supernatanten. Resuspendera cellerna i 250 mikroliter av 0,9% (vikt / vol) natriumkloridlösning (NaCl, M r: 48,44 g / mol) och sprida 50 mikroliter på följande selektiva plattor: SD-trp, Sd-Leu, SD-Trp- leu, SD-trp-leu-his, och SD-trp-leu-his-ade. Inkubera plattorna under 3 – 4 dagar vid 30 ° C. Efter den första dagen av inkubation, försegla plattorna med plastparaffinfilm för att förhindra plattorna från att torka ut. Kontrollera jäst tillväxt på plattorna. 6. Testa Redovisning av Effector Testa uttrycket av effektor genom Western blot-42 med en antikropp mot Lex-A tagg som är kopplad vid N-terminalen av effektor näruttryckt från pLexA-N. Observera: Tänk på att translationellt smält Lex-A tagg lägger cirka 24 kDa till den faktiska vikten av proteinet av intresse. Detta är viktigt när identifiera proteinstorleken i Western blöt. 7. Y2H Screen Strimma pLexA-atp00189 (effektor) transformerade NMY51 på ett nytt SD-trp plattan och låt det växa till 2 – 3 dagar vid 30 ° C, tills röda kolonier visas. Ympa 3 ml SD-trp-medium i en liten skakkolv med en röd koloni från agarplattan och inkubera över natten vid 30 ° C med skakning vid 120-150 rpm. Ympa 20 ml av SD-trp i en skakkolv med en ml av natten kultur och låta det växa i 8 timmar. Justera kulturen till OD 600 = 0,2 genom tillsats av SD-trp-medium och inokulera 2x 100 ml i skakning kolvar med 10 ml av startkulturen vardera. Växa över natten under skakning vid 30 ° C. Obs: Se till att jästen inte växa till OD 600> 0,5 och späd med färsk SD-trp. Mät OD 600 och pelleten 120 OD 600 "enheter." Till exempel, om en OD 600 av 1,2 mätes, spinn ner 100 ml, kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 800 ml förvärmda 2x YPAD i en skakkolv med en magnetisk omrörarstav. Centrifugera ner en 2-ml alikvot, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i vatten. Se till att OD 600 av jästsuspensionen är mellan 0,15 och 0,2. Om inte, justera med 2x YPAD eller lägga till mer jäst från natten kultur. Notera: 2x YPAD är mörkbrun och kan påverka resultatet av den OD-mätning. Således är det nödvändigt att återsuspendera jästcellerna i vatten innan OD-bestämning. Som ett alternativ, kan 2x YPAD framställas genom att steriliserings glukos separat, såsom beskrivits i steg 5.1.8 notera, vilket förhindrar den mörka färgningen av mediet. Inkubera resterande jästkultur i en appropriately dimensionerad skakkolv (800 ml i en 2 L skakkolv eller dela 2 x 400 ml i två 1 L skakkolvar) och inkubera vid 30 ° C, 120 till 150 rpm. Mät OD 600 om varje 1,5 h tills en OD 600 av 0,6 uppnåtts (tar 4-6 h). Under tiden, förbereda de lösningar som beskrivs i nästa steg. Litiumacetat-förmedlad transformation Lös upp 2% vikt / volym laxspermie-DNA i vatten och koka 500 mikroliter under 5 min i ett vattenbad vid 100 ° C. Placera röret på is under 2 min och upprepa uppvärmningssteget. Hålla DNA på is tills vidare användning. Förbered följande blandningar: TE / LiOAc mix: Blanda 3,08 ml av 1 M LiOAc, 3,08 ml 100 mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5), och 21,84 ml av sterilt dubbeldestillerat vatten. PEG / LiOAc mix: skörde 4,2 ml 1 M LiOAc, 4,2 ml mM Tris / 10 mM EDTA (pH: 7,5) och 33,6 ml 50% (vikt / volym) PEG 4000. Centrifugera 800-ml jästkultur (OD 600 = 0,6)vid 700 xg under 5 min för att pelletera cellerna. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 200 ml av sterilt dubbeldestillerat vatten. Pellets cellerna igen vid 700 x g under 5 min och kasta bort supernatanten. Obs: Om det är nödvändigt dela suspensionen i flera flaskor för centrifugering. De vätskevolymer i 7.7.3. och 7.7.4. avser hela pelleten härrörande från 800 ml suspension. Återsuspendera pelleten i 16 ml TE / LiOAc mix (se steg 7.7.1.1); spinn ner vid 700 xg under 5 min och kasta bort supernatanten. Återsuspendera pelleten i 9,6 ml av TE / LiOAc mix. Förbereda följande reaktion blandar i lämplig storlek reaktions polypropen fartyg: 12 injektionsflaskor med 7 | ig av pGAD-HA-cDNA-bibliotek vektor, 100 mikroliter av 2% DNA från laxsperma (se steg 7,7), och 2,5 ml av PEG / LiOAc mix. Lägg 600 mikroliter av jästcellsuspension från steg 7,10 till var och en av de 12 flaskorna och blanda kraftigt under en minut. Inkubera reaktionsblandningen under 45 min vid 30 ° C i ett vattenbad end blanda kraftigt varje 15 min. Lägg 160 mikroliter DMSO till varje flaska och blanda kraftigt. Inkubera blandningen under ytterligare 20 min vid 42 ° C. Pelletera cellerna vid 700 xg under 5 min, kasta supernatanten och återsuspendera varje pellet i 3 ml av 2x YPAD. Pool alla celler (med totalt 36 ml från 12 flaskor) i en 100 ml skakkolv och inkubera jästen under 90 minuter vid 30 ° C och 120 rpm. Pellets cellerna under 5 minuter vid 700 xg och kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 4,5 ml steril 0,9% (vikt / volym) NaCl och blanda väl genom att försiktigt pipettera upp och ner med en 10-ml serologisk pipett. Uttag 50 mikroliter och förbereda tiofalt utspädningar i 0,9% NaCl från 1:10 upp till 1: 1000. Plattan 100 mikroliter av varje spädning på 90-mm petriskålar innehållande SD-trp-leu-agar. Sprid resten av den outspädda jäst resuspension på 16- x 150 mm petri diameter rätter med SD-trp-Leu-hans-ade agar. Lägg 3-AT till mediet för att minska självaktivering. Inkubera SD-trp-leuplattor för tre dagar och SD-trp-Leu-hans-ade plattor för fyra dagar vid 30 ° C. OBS: Kloner som visas på de selektiva plattorna är (potentiella) samverkande par och bär pGAD-HA plasmid som kodar för betet samverkande partner. Bestämma transfektionseffektiviteten genom att räkna kolonierna av de olika serieutspädningar på SD-trp-Leu selektionsplattor. Överföra varje klon genom att plocka och strimmor kolonin med en steril pipettspets på färska SD-trp-leu-his-Ade-selektiva plattor. Inkubera plattorna under 24 h vid 30 ° C. Upprepa detta steg varje dag tills totalt fem passager nås. 8. Analys av klorna från selektiva plattor Förbereda en steril 2-ml reaktionsröret med 1 ml av SD-trp-leu-his-ade för varje klon under en steril huva. Stansa ett hål i varje rör med en varm nål och täcka hålet med en bit av gasgenomsläppligt sealer. Inokulera varje flaska med färsk koloni mate Rial från en klon (steg 7,17, använd kloner efter 5: e passage) och inkubera under 24 timmar vid 30 ° C, skakning vid 150 varv per minut. OBS: Det är viktigt att ta kloner från ett färsk platta, eftersom jäst tagen från plattor lagrade under flera dagar vid 4 ° C inte växer tillräckligt inom 24 timmar i flytande medium. Pellets jästen under 5 minuter vid 4000 xg och kassera supernatanten. Resuspendera pelleten i lämplig resuspension buffert (från respektive plasmid DNA miniprep kit) och överföra den till en ny 2,0 ml reaktionsrör. Tillsätt 100 | il av syratvättade glaspärlor (425- till 600-um i diameter) och blanda kraftigt under 5 min. Lägga den respektive lysbuffert och fortsätt med plasmiden rening med användning av en plasmid beredning mini kit genom att följa tillverkarens instruktioner. Eluera plasmid-DNA med 50 | il vatten. Använd DNA från steg 8,3 för en sekvenseringsreaktion med bytet plasmiden specifik primer, GAL4ADseqref "> 41 5'ACCACTACAATGGATGATG -3 '. Kontrollera samspelet med de novo co-transformera 43, 44 betet och bytet vektorn. Välj den transformerade jästen på SD-trp-Leu-hans-ade selektionsplattor.

Representative Results

Innan kan utföras själva Y2H skärmen betet måste testas för självaktivering. Detta uppnås genom att transformera betet expressionsvektor tillsammans med den tomma byten biblioteket vektor och kontroll av tillväxt på selektiva plattor. För att analysera huruvida phytoplasmal protein ATP_00189 är självaktiverande, var självaktivering test som beskrivs i avsnitt 5. betet plasmiden kompletterar trp och bytet plasmiden leu auxotrofi av S. cerevisiae NMY51 40. En framgångsrik co-transformation således kännetecknas av tillväxt på selektiva plattor som saknar trp och Leu. Interaktion av betet och ett byte protein leder till en komplettering av hans och ade auxotrofi av NMY51. Om självaktivering av betet i frånvaro av en interaktion visas, växer jästen på selektiva plattor som saknar hans och ade. Stark och svag självaktivering kan inträffa. Stark självaktivering av betet kännetecknas av tillväxten av co-transformerade jäst på trp-Leu-hans-ade utarmat selektionsplattor. Svag självaktivering leder till tillväxt på trp-leu-his men inte på trp-leu-his-Ade utarmat selektionsplattor. Korrekt positiva kontroller är nödvändiga för att tolka resultaten av självaktivering analysen. En sammanfattning av de förväntade resultaten av självaktivering analysen och deras tolkning ges i tabell 1 och åskådliggörs i figur 1. Figur 1: Exempel på bete självaktivering Tester av ett bete Innan du utför en Y2H skärm. S. cerevisiae NMY51 ades samtransformerades med samverkande bete (PLEX-p53) och bytesdjur (pACT-larget) som en positiv kontroll (vänster fält: ac), en svagt självaktiverande plus en tom byte library vektor (mitten panel: df) och en icke självaktiverande bete plus en tom byte bibliotek vektor (högra panelen: gi). Co-transformerade jästen odlades på SD-plattor som saknar trp och Leu (övre panelen: a, d, g), trp, leu och hans (mitten panel b, e, h) och trp, leu, hans och ade (lägre panel: c, f, i). Selektion på medium som saknar trp och leu är en positiv kontroll för framgångsrik samtransformering, som betet vektor kompletterar trp auxotrofi och bytet vektorn leu auxotrofi av NMY51 (tillväxt på SD-trp-leu). Vid en interaktion mellan bete och bytesdjur eller en självaktivering av betet, är reportern uttryck för NMY51 påslagen och kompletterar hans och ade auxotrofi (tillväxt på SD-trp-Leu-hans-ade). En svag självaktivering kännetecknas av tillväxt på SD-trp-Leu-hans plattor (mitten panel, df). Svag självaktivering av ett bete måste minskas innan för att analysera beteti en Y2H skärm, exempelvis genom att tillsätta 3-AT till selektiva media. Aminosyra uttömning anges med "-" i respektive media namn. Klicka här för att se en större version av denna siffra. pLexA-N-atp00189 ingen kolonier ingen tillväxt ingen tillväxt ingen tillväxt ingen tillväxt ingen pGAD-HA ingen tillväxt kolonier ingen tillväxt ingen tillväxt ingen tillväxt pLexA-N ingen kolonier ingen tillväxt ingen tillväxt ingen tillväxt ingen tillväxt pLexA-N pGAD-HA kolonier kolonier <td> kolonier ingen tillväxt ingen tillväxt pLexA-p53 pACT-larget kolonier kolonier kolonier kolonier kolonier pLexA-N-atp00189 pGAD-HA kolonier kolonier kolonier ingen tillväxt ingen tillväxt Tabell 1: Förväntade resultat i ett bete Självaktiveringsanalys. Omvandlingen av S. cerevisiae NMY51 ger differential tillväxt på selektiva media baserad på egenskaperna hos samtransforme bete och bytesdjur. Tillväxt på selektiva plattor utvärderades efter transformation av olika vektorkombinationer (AF) efter 72 h inkubation vid 30 ° C. Svag självaktivering karakteriseras av jäst tillväxt på SD-trp-Leu-hans och stark självaktivering genom tillväxt på SD-trp-Leu-hans-ade val plates i frånvaro av en interaktion partner. Den pLexA-N kodade phytoplasmal effektor ATP_00189 uppvisar inte självaktivering, som kännetecknas av oförmågan hos betet vektor transformerad NMY51 att växa i frånvaro av hans och ade. Beroende på betet, kan en Y2H skärm får många jästkloner växer på selektiva plattor. Alla kloner måste analyseras och kontrolleras för eventuella uppsägningar. Även om en normaliserad cDNA-bibliotek har använts, är det mycket sannolikt att ett påverkare är representerad i många olika kloner. Beroende på vilken bibliotekskloningsteknik, är det även möjligt att endast fragment av den fullständiga genen infogas i vissa bytes vektorer. Det är således lämpligt att de novo amplifiera (från cDNA) och subklona fullängdsgenen enligt påverkare och för att testa interaktionen i ett ett-till-ett Y2H analys (Figur 2). <img alt = "Bild 2" src = "/ filer / ftp_upload / 55.150 / 55150fig2.jpg" /> Figur 2: Exempel på en interaktion mellan bete och Prey i en Y2H Experiment. En jäst två-hybrid (Y2H) skärm utfördes och plasmider från positiva Interactor kloner renas. Bytet vektorn sekvenserades och Malus x domestica värdinteraktionspartners MdTCP24 och MdTCP25 identifierades. Som en negativ kontroll MdTCP34 (för vilken ingen Interactor identifierades i Y2H biblioteksskärmen) subklonades parallellt. Fullängdsgener amplifierades från äpple-cDNA, subklonad in i bytet vektor (sam-cistronically uttrycker aktiveringsdomänen AD) och de novo samtransformerade med betet vektor som uttrycker den bakteriella effektor ATP_00189 kopplad till den DNA-bindande domänen (BD). Denna siffra är hämtad från 28. Klicka här för att se en störreversion av denna siffra.

Discussion

I Y2H skärmen, är den potentiella effektor proteinet samuttrycks med olika hypotetiska interagerande proteiner (steg 7). Varje växande jäst klonen innehåller betet men en (potentiellt) olika Interactor. De interagerande proteinerna är kodade i ett cDNA-bibliotek som klonas in i bytes plasmider. Betet och bytet plasmiderna varje co-cistronically kod för en del av en jästtranskriptionsfaktor. I händelse av en fysisk interaktion mellan betet (effektor) och en byte plasmidkodad påverkare är de två transkriptionsfaktor delar (den DNA-bindande domänen och aktiveringsdomän) förenas, och reportergenen expression induceras. Jästen är i stånd att växa på histidine- och adenin-utarmat SD selektionsplattor. Den typ av byte-cDNA-bibliotek är beroende av det avskärmade effektor och måste väljas i enlighet därmed. Bytet och bete vektor, liksom jäststam, måste vara förenliga. I denna skärm, en LexA DNA-bindande domänen och Gal4 aktiverings domain användes som de kompatibla jästtranskriptionsfaktom enheter. CDNA-biblioteket kan individuellt konstrueras, specialtillverkat, eller erhållas kommersiellt. Framställningen av cDNA byte biblioteket är inte en del av detta protokoll. I detta protokoll, var egentillverkade, normaliserad cDNA-bibliotek från RNA av Malus x domestica blad används och klonades in i pGAD-HA ^41. Effektorn (bete) -uttryckande jäststammen transformerades med bytet bibliotek och kloner selekterades på histidine- och adenin-utarmat SD selektionsplattor. Att extrahera plasmid-DNA från de jästkolonier, är en kolumnbaserad DNA-plasmid mini-kit för bakterier rekommenderas i kombination med en mekanisk sönderdelning steg med användning av glaspärlor för att förbättra jäst-lys (steg 8). I denna plasmid rening, kommer betet och bytet vektorn renas samtidigt i relativt låga koncentrationer. Emellertid är mängden av plasmid-DNA tillräckligt för att identifiera växelverkan partner genom sekvense witHout tidigare plasmid förökning (steg 8,4). Som ett alternativ kan DNA renas i steg 8,4 omvandlas till kompetent E. coli och selekterades med byte vektormedierad antibiotikaresistens (t.ex., ampicillin den i händelse av pGAD-HA). Den valda E. coli kolonier bär endast pGAD-HA bibliotek plasmid och högavkastande plasmidrening kan utföras med dessa kloner.

Den framgångsrika omvandlingen av pLexA-N och pGAD-HA konstruktioner kompletterar tryptofan och leucin auxotrofi av NMY51. En interaktion mellan effektor och ett protein (kodad på pGAD-HA) leder till aktivering av reportersystemet i NMY51 stammar. I fallet med självaktivering, NMY51 transformerad med effektorn som uttrycker pLexA-N i kombination med den tomma biblioteket vektor pGAD-HA växer på selektiva plattor som saknar trp-leu-his-ade, på grund av den oönskade aktiveringen av NMY51 reportersystem ^40. Den självaktivering kan vara weak och kan förekomma i frånvaro av trp-leu-his, eller aktiveringen kan vara stark och som kännetecknas av tillväxt på trp-Leu-his-ade plattorna ^41. Självaktivering kan orsaka en massiv bakgrund av falskt positiva kloner i själva Y2H skärmen. För att undvika detta måste en självaktivering test med betet utföras, där effektorn uttrycker vektor samtransformeras med den tomma biblioteket vektor. I detta experimentella inställning måste reporter genuttryck inte framkallas. Om självaktivering (dvs tillväxt på selektiva plattor) är synlig i testet, kan mediet kompletteras med olika koncentrationer av 3-amino-1,2,4-triazol ⁴⁵ (3-AT). 3-AT är en hämmare av imidazoleglycerol-fosfat dehydratas (HIS3), ett enzym som är viktigt vid histidin biosyntesen ^46. Tillskott med 3-AT kan minska de svaga effekter av självaktivering under Y2H skärmar ^47,48. Olika koncentrationer av 3-AT bör testas. I detta protokoll, en – var 40 mM 3-AT användes. Den lägsta koncentration som leder till förtryck av självaktivering bör därefter användas i Y2H skärmen. De selektiva plattor av självaktiveringsanalys det kan endast utvärderas om de SD-trp-Leu plattor av samtransformation innehåller ett tillräckligt antal kloner. Som en indikation ≥ 500 kolonier per 90-mm (diameter) petriskål är tillräckliga. Att fastställa den exakta transfektionseffektivitet, är det rekommenderat att framställa serieutspädningar av samtransformerade jäst och att sprida dem på SD-trp-Leu-plattor.

För att minska självaktivering, kan effektorn klonas in pLexA-C, ett bete expressionsvektor som säkringar LexA tagg till C-terminalen av proteinet. Orienteringen av Lex-A tagg kan dämpa självaktivering ^24. Det är emellertid inte möjligt att i varje enskilt fall för att minska eller avskaffa självaktivering. Bildandet avröda eller rödaktiga kolonier indikerar en svag eller falskt positivt samspel. Den ade2 reportergenen av NMY51 aktiveras bara när det kommer till en protein-proteininteraktion, vilket i sin tur blockerar ackumuleringen av ett rött färgämne i denna jäststam ^40. I avsaknad av en interaktion, NMY51 är rödaktiga, medan kolonier som bär starka Interactmedlemmar är vita. Observation av kolonifärg på selektionsplattor ger således en ytterligare viktig ledtråd för att bedöma om de respektive kolonierna är sant-eller falskt positiva Interactmedlemmar.

Det är slutligen nödvändigt att anpassa eller ändra vissa analys inställningar med hänsyn till den typ av bete och interaktionsegenskaper. Vid det här laget har ett antal förbättringar och derivattekniker för den gemensamma Y2H införts för att göra det möjligt att analysera ganska svåra proteininteraktioner i olika värdsystem. En översyn av Stynen et al. ⁴⁹ adresser ennd beskriver olika aspekter av Y2H, dess förbättringar och anpassningar, och därmed ger värdefull information om hur man väljer rätt interaktion analys.

Y2H skärmar och härledda tekniker har blivit allmänt används i olika forskningsområden, varhelst krävs identifiering av binära proteininteraktioner. Även om kritiska kontroller genomförs, såsom självaktiveringstester av betet och en-till-en re-transformationer av de identifierade interagerande proteiner är Y2H benägen att ge falska resultat ^{26, 50, 51.} Jästen som en modell är inte lämplig för alla interaktionsstudier. Jäst inte nödvändigtvis utgör en cellulär miljö som stöder den lämpliga post-translationell modifiering och vikning för varje protein ^24. Vidare i inställningen Y2H, proteinerna överuttryckta och deras uttryck är inte kontrollledd av deras naturliga promotor. Den Y2H tvingar proteininteraktionspartners till kärnan, vilket inte nödvändigtvis deras naturliga subcellulär destination. De interna cellulära omständigheterna kring interaktionen kan således inte reflekteras av jäst och kan leda till falskt negativa eller falskt positiva resultat. De flesta Y2H är baserade på jäst auxotrofi komplemente som en selektiv princip. Detta närings val kännetecknas av hög känslighet, men på bekostnad av minskad selektivitet jämfört med andra (t ex kromogen reporter) analyser ^49. Om unreducible självaktivering (se ovan) eller andra begränsningar uppträder under en viss effektor är Y2H inte någon lämplig analys ^25. I tabell 1 och figur 1, är de förväntade resultaten av självaktivering testet ges. Frånvaron av verkliga interaktioner (dvs falska negativa) kan orsakas av proteintoxicitet, felaktig translationell proteinbearbetning, steriskt hinder av interaktionen, underrepresenterade interaktions partners i bytet bibliotek, membran lokalisering av betet, eller saknade komponenter som krävs för interaktionen ^24.

Det rekommenderas att de novo förstärka fullängdsgenen av den identifierade interagerande protein från cDNA, subklona det in pGAD-HA, och utför en interaktionsanalys en-till-en genom att omvandla den genererade pGAD-HA-konstruktionen i betet-uttryckande NMY51 stam. Detta är nödvändigt eftersom den observerade påverkare närvarande i bytet biblioteket kanske endast vara ett fragment av en större protein. Men det är bara tillgänglig om betydande genomisk och transcriptomic sekvensdata finns informationen för respektive gen fullängds. Omvandlingen protokoll för självaktiveringsanalys som beskrivs här kan användas för en sådan en-till-en analys och samspelet mellan betet och Interactor måste vara reproducerbara.

<p class = "jove_content"> interaktioner i en Y2H skärm måste alltid bekräftas av en annan oberoende teknik. Detta oberoende teknik måste vara närmare naturen av själva interaktionen protein-protein. I fallet med phytoplasmal effektor ATP_00189 var interaktionen med TCP transkriptionsfaktorer Malus x domestica verifieras i planta med bimolekylärt fluorescerande komplettering (BiFC) i Nicotiana benthamiana protoplaster ²⁸ (inte en del av detta protokoll). Den effektorprotein ATP_00189 härleddes från växtpatogen P. mali. I planta BiFC således valt att kontrollera ATP_00189 interaktioner med Malus x domestica transkriptionsfaktorer tidigare identifierats i Y2H ^28. BiFC är en protein-proteininteraktion assay som inte kräver den subcellulära translokeringen av de interagerande proteiner till cellkärnan i syfte att aktivera reportern systemet <sup class = "xref"> 52. Vidare i planta uttryck och modifiering maskiner härmar miljön av den naturliga samverkan mellan anläggningen bakterie effektor i växtvärden. Dock är inte möjlig global skärmen med BiFC.

Det finns flera steg i protokollet som noggrant måste åtgärdas. När förstärkning av genen av intresse (steg 4), är det viktigt att utesluta att primers binder till växt-DNA. Således måste DNA från icke-infekterade växter inkluderas som en negativ kontroll. Sekvensen för genen av intresse får inte innehålla EcoRI- och Sall-restriktionsställen som används för den riktad kloning av skäret. Om sekvensen inte innehåller dessa platser, måste olika restriktionsenzymer för kloning väljas. Jäst omvandling är en central metod under detta protokoll. Transfektionseffektiviteten beror på kompetensen hos jästcellerna, deras livskraft, tillväxt tillstånd, och kvaliteten på transfektion Reagent ^{53, 54.} För det föreslagna protokollet, är det starkt rekommenderat att använda jäst från färska plattorna inte äldre än två veckor (hålls vid 4 ° C) när de utför de transformationer. Ofta är tillväxten av transformerade jäst försenad när selektiva flytande kulturer ympas med kolonier från gamla agarplattor. Det är också till hjälp att använda en flytande startkultur som ett inokulum för de faktiska experimenten och att inte använda jästen direkt från plattan. Låg effektivitet när transfektion bytet i betet uttrycker jäst kan leda till underrepresentationen av vissa bytesproteiner (potentiella Interact) och kan därmed skev hela skärmen. I detta protokoll, en jäst transfektion effektivitet ~ 150.000 cfu / ig transfekterat DNA i Y2H fungerat bra.

Att känna bristerna och nackdelarna med den Y2H teknik och tolka resultaten på ett kritiskt och ändamålsenligt sätt är nödvändig för att dra correct slutsatser. Y2H analyser och derivat har använts under många år och har genomgått många förbättringar och anpassningar med avseende på de olika betes egenskaper, subcellulära lokalisering av samspelet, de förväntade bindningspartner, och andra faktorer som kan krävas för interaktionen (se Y3H ^{55, 56, 57).} Nyligen har array-baserad Y2H skärmar utvecklats som möjliggör automatiserad, hög genomströmning analys av ett stort antal beten mot miljontals bytesdjur ^58. Framtiden troligen ligger i automatisering och hög genomströmning sätt att denna analys för att möjliggöra att klarlägga komplexa signaleringsvägar och interactomes i olika forskningsområden.

Materials

Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB)	Applichem	A6284	for DNA preparation
Trishydroxymethylaminomethane (Tris)	Applichem	A2264	for media and buffer
Sodiumchloride (NaCl)	Applichem	A2942	for media and buffer
Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA)	Applichem	A2937	for media and buffer
N-Lauroylsarcosin sodium salt	Applichem	A7402	for DNA preparation
ammonium acetate	Sigma-Aldrich (Fluka)	9688	for DNA preparation
2-mercaptoethanol	Applichem	A1108	for DNA preparation
Isopropanol (2-Propanol)	Applichem	A3928	for DNA preparation
Ethanol	Sigma-Aldrich (Fluka)	51976	for DNA preparation
RNAse	Applichem	A2760	for DNA preparation
Chloroform:Isoamyl 24:1	Applichem	A1935	for DNA preparation
Proofreading Polymerase (e.g. iProof)	Bio-Rad	203433	for PCR
EcoRI	Thermo Scientific	ER0271	for cloning
SalI	Thermo Scientific	ER0641	for cloning
Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick)	Qiagen	28104	for cloning
Kanamycin Sulfate	Applichem	A1493	for microbiological selection
3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT)	Sigma-Aldrich	A8056	for self-activation assay
L-Arginine Monohydrochloride	Applichem	A3680	for yeast culture
L-Isoleucine	Applichem	A3642	for yeast culture
L-lysine Monohydrate	Applichem	A3448	for yeast culture
L-Methionine	Applichem	A3897	for yeast culture
L-Phenylalanine	Applichem	A3464	for yeast culture
L-Threonine	Applichem	A3946	for yeast culture
L-Tyrosine	Applichem	A3401	for yeast culture
L-Uracile	Applichem	A0667	for yeast culture
L-Valine	Applichem	A3406	for yeast culture
L-Adenine Hemisulfate Salt	Applichem	A1596	for yeast culture
0.22 µm Pore Filter	Sartorius	16541	for sterile filtration
L-Histidine Monohydrochloride	Applichem	A3719	for yeast culture
L-Leucine	Applichem	A3496	for yeast culture
L-Tryptophane	Applichem	A3410	for yeast culture
Yeast Nitrogen Base	Sigma-Aldrich	51483	for yeast culture
D-Glucose Monohydrate	Applichem	A1349	for yeast culture
Agar	Fisher Scientific	BP2641-1	for yeast and bacteria culture
Peptone	Applichem	A2208	for yeast culture
Polyethylene Glycol 4000 (PEG)	Applichem	A1249	for yeast transformation
Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc)	Applichem	A3478	for yeast transformation
Salmon Sperm DNA	Applichem	A2159	for yeast transformation
Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region)	Millipore	06-719	for Western blot
Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit)	Sigma-Aldrich	PLN350	for plasmid purification from yeast and bacteria
Acid Washed Glass Beads	Sigma-Aldrich	G8772	for plasmid purification from yeast
Ampicillin Sodium Salt	Applichem	A0839	for microbiological selection
Yeast Extract	Applichem	A1552	for yeast culture
Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301)	Eppendorf	Z368245 (Sigma)	for DNA preparation
Bait vector (e.g. pLexA-N)	Dualsystems	P01004	for Y2H
Prey vector (e.g. pGAD-HA)	Dualsystems	P01004	for Y2H
Control prey vector (e.g. pLexA-p53)	Dualsystems	P01004	for Y2H
Control bait vector (e.g. pACT-largeT)	Dualsystems	P01004	for Y2H
Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells)	Invitrogen	C640003	for cloning
Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51)	Dualsystems	P01004	for Y2H
Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M)	Sigma-Aldrich	P7793-1EA	for yeast and bacteria culture
Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal)	Greiner	676 051	for yeast culture
PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler)	Bio-Rad	1861096	for PCR
quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System)	Bio-Rad	1855195	for quantitative PCR
Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R)	Eppendorf	5417 R	general lab equipment
Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R)	Eppendorf	5804 R	general lab equipment
Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free)	5Prime	2500010	for PCR and DNA works
Scalpell	Swann-Morton	0301	for DNA preparation
Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone))	VWR-International	514-0073 (European Catalogue number)	for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 90 mm	Greiner Bio-One	633180	for yeast and bacteria culture
Petri dishes Ø 150 mm	Greiner Bio-One	639161	for yeast culture
Photometer (e.g. BioPhotometer)	Eppendorf	550507804	for yeast culture
Photometer Cuvettes	Brand	759015	for yeast culture
Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7)	Memmert	WB7	for yeast transformation
Western Blot Equipment	Bio-Rad	diverse	for protein detection
dNTPs	5Prime	2201210	for cloning
Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks)	Sigma Aldrich	Z232793, Z232858, Z232866	for yeast and bacteria culture
Shaking Incubator (e.g. GFL 3031)	GFL	3031	for yeast and bacteria culture
Incubator	Binder	KB 53 (E3.1)	for yeast and bacteria culture
Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825)	Omniwash	IF 825	general lab equipment
0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene)	Eppendorf	0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml)	general lab equipment
Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 µl)	Eppendorf	diverse	general lab equipment
Spreader	Sigma-Aldrich	SPR-L-S01	for yeast and bacteria culture
Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker)	IKA	3617000	general lab equipment
T4-Ligase	Thermo Fisher	EL0011	for cloning
Fridge (4°C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000)	Liebherr	81.767.580.4	general lab equipment
Freezer (-20°C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216)	Liebherr	G5216	general lab equipment
Graduated Cylinder (e.g. Brand)	Sigma Aldrich	Z327352; Z327417; Z327441	general lab equipment
Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand)	Thermo Fisher	S55701	for yeast and bacteria culture
Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2)	Integra-Biosciences	155000	general lab equipment
Cuvettes for Electroporation (1 mm)	Molecular Bio Products	5510-11	for bacteria transformation
Electroporator (e.g. Eporator)	Eppendorf	4309000019	for bacteria transformation
Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System)	Bio-Rad	1708280	general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml)	VWR-International	525-0403 (European Catalogue number)	general lab equipment
Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml)	BD Falcon	352096	general lab equipment
Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M)	Thermo Scientific	P2325	for ligation
adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM))	Ambion	AM8110G (distributed by Thermo Scientific)	for ligation
Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements)	Sigma-Aldrich	Y2021 Sigma	for yeast culture (ready-made mix)