Levende konfokal billedbehandling giver biologer med et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingen. Her præsenteres en detaljeret protokol for live konfokal billedbehandling for at udvikle Arabidopsis blomster.
Studiet af planters vækst og udvikling har længe påberåbt eksperimentelle teknikker under anvendelse døde, fikserede væv og med dårlig cellulær opløsning. Nylige fremskridt i konfokalmikroskopi, kombineret med udviklingen af en lang række fluoroforer, har overvundet disse problemer og åbnede mulighed for at undersøge ekspressionen af flere gener samtidigt, med en god cellulær opløsning, i levende prøver. Levende konfokal billedbehandling giver plantebiologer med et kraftfuldt værktøj til at studere udviklingen, og har været flittigt brugt til at studere rodvækst og dannelsen af laterale organer på flankerne af skuddet apikale meristem. Men det har ikke været almindeligt anvendt til studiet af blomsten udvikling, dels på grund af udfordringer, der er specifikke for billeddannelse blomster, såsom bægerbladene, der vokser over blomsten meristem, og bortfiltrere fluorescens fra underliggende væv. Her præsenteres en detaljeret protokol til at optræde live konfokal billedbehandling på live, udvikling arabiskeidopsis blomsterknopper, der bruger enten en opretstående eller et omvendt mikroskop.
Meste af plantelegemet danner post-embryonically fra grupper af stamceller beliggende ved eller i nærheden af spidsen – eller apikale meristemer – af skud og rødder. Alle overjordiske strukturer i voksen plante stammer fra skuddet apikale meristem (SAM), der kontinuerligt producerer laterale organer på dens flanker: blade i den vegetative fase, og blomster meristemerne (FMS) efter det overgange til den reproduktive fase. FM-stationer til gengæld udvikler sig til blomster. Mens Arabidopsis SAM producerer laterale organer én ad gangen, i en iterativ, spiralmønster, FM-stationer producere fire typer blomsterorganer inden for fire hvirvler, i en delvist synkron måde, med flere udviklingsprogrammer unraveling samtidigt. De genetiske netværk ligger til grund for specifikation af identiteten af de forskellige blomster organer er blevet delvist tydet (til anmeldelser, se referencer 1, 2), men mange aspekter af blomst development, såsom blomster organ positionering og definitionen af grænserne mellem hvirvler, forbliver dårligt forstået.
Tidlige molekylærgenetiske studier af plantens udvikling hovedsagelig påberåbt teknikker såsom in situ hybridisering og GUS reportere til at analysere genekspression. Mens disse metoder har givet et væld af oplysninger og i høj grad bidraget til vores forståelse af planters vækst og blomst udvikling, er der vigtige begrænsninger: de mangler god cellulære opløsning, ikke giver mulighed for let observation af udtrykket mønster af flere gener i den samme prøver, og vigtigere er, kan kun anvendes på døde, fikserede væv. Nylige fremskridt i konfokalmikroskopi har overvinde disse begrænsninger, og give udviklingsmæssige biologer med et kraftfuldt værktøj til at undersøge de processer underliggende plante morfogenese. Især konfokalmikroskopi giver mulighed for observation af levende væv og organer i hele deres dannelse, hvilket er critical til fuldt ud at forstå en indbegrebet dynamisk proces såsom udvikling.
Levende konfokal billeddannelse er blevet grundigt anvendt til at analysere antenne vækst af planter og produktionen af laterale organer ved SAM (f.eks referencer 3, 4, 5, 6), men med undtagelse af nogle få rapporter (f.eks referencer 7, 8, 9, 10), det har ikke været almindeligt anvendt til studiet af blomsten udvikling. Protokoller for levende konfokal billeddannelse af SAM er tilgængelige (fx referencer 11, 12), og giver et godt udgangspunkt for, hvordan til billedet udviklingslandene blomsterknopper, der omgiver SAM. Men billedbehandling blomsterknopper præsenterer særlige udfordringer: for eksempel,blomsterknopper hurtigt blive større end SAM, og i trin 4, bægerblade starte dækker FM (faser som beskrevet i reference 13), og dæmpning fluorescensen fra underliggende væv (figur 2A). Her giver vi en detaljeret protokol forklarer, hvordan at optræde live konfokal billedbehandling på at udvikle Arabidopsis blomsterknopper ved hjælp af enten en opretstående eller et omvendt mikroskop og en vand-dypning linse. Vi har tidligere udgivet denne protokol i henvisning 14.
Her giver vi en protokol for billeddannelse af levende, udvikling Arabidopsis blomsterknopper med en konfokal mikroskop og en vand-dypning linse. Selv om dette kan gøres med enten en opretstående eller et omvendt mikroskop, er det nemmere og hurtigere at bruge den tidligere. Det er også værd at bemærke, at forskellige konfokale systemer varierer betydeligt med hensyn til hastighed, følsomhed og evne til at adskille bølgelængder. De bedste konfokale mikroskoper tillader nu at afbilde flere forskellige kanaler (f.eks GFP, YFP, dsRed og propidiumiodid; Figur 2G) i de samme prøver. Nogle konfokale mikroskoper er udstyret med en spektral detektor, som kan opsamle fluorescens fra flere fluorophorer samtidig og adskille dem bagefter. Ved brug af en almindelig detektor, men et sæt af lasere og filtre skal bruges til at begejstre og adskille fluorescens fra forskellige fluoroforer. Nogle fluoroforer har fuldt distinkt emission spektre (f.eks FFP etd YFP), og kan afbildes samtidigt. Andre fluorophorer har delvist overlappende emissionsspektre (f.eks GFP og YFP), og som regel skal afbildes separat, hvilket øger afbildningstiden. Billeddannelse nære fluorophorer ofte kræver også begrænse hvor meget af spektret opsamles for hver kanal for at forhindre fluorescens fra en fluorofor i at lække ind i en anden kanal. Dette forårsager et tab af intensitet af det opsamlede signal, som kan kompenseres ved en stigning i lasereffekt og forstærkning. forlænget afbildningstiden og øget lasereffekt kan dog blege og / eller beskadige prøven. Øget laser magt og / eller gevinst kan også øge baggrundsstøj. Optimering af signalintensiteten, opløsning og billeddannelse tid for hver prøve sker gennem en trial-and-error proces og involverer permanente kompromisser.
Denne protokol forklarer, hvordan at optræde live konfokal billeddannelse af blomsterknopper udvikler på flankerne af en dissekeret skudspidsen. Detkan argumenteres, at det forhold, at skudspidsen ikke er forbundet med resten af anlægget og vokser i et medium, der indeholder cytokininer kan påvirke SAM og blomster udvikling. Imidlertid blev dette medium designet empirisk gennem en trial-and-error proces for at sikre det dissekerede skyde apikale dannelsesvæv producere nye blomsterknopper ved den normale plastochron, og at disse blomsterknopper udvikle sig normalt 15. Heller ikke bægerblad dissektion ikke at påvirke genekspressionsmønstre eller udvikling af resten af blomsten. Andre protokoller detaljer, hvordan at optræde live konfokal billeddannelse af SAM stadig fastgjort til resten af planten (f.eks referere 11). Sådanne protokoller kunne tilpasses til, og tilbyder et nyttigt alternativ til billeddannelse udvikle blomster, især når studerer cytokinin-relaterede processer. De præsenterer adskillige ulemper dog: stilken elongates og drejninger, og ændrer orienteringen af blomsterknopper; -ennd mens billeddannelse en skudspidsen knyttet til resten af planten fungerer godt med en opretstående mikroskop, er det langt mere kompliceret at gøre det med et omvendt mikroskop.
Nedsænkning linser har en bedre numerisk åbning (NA) end "tørre" linser (dvs. linser, der er adskilt fra prøven ved luft), og giver derfor en finere opløsning af prøven, hvilket er kritisk, når der anvendes et konfokalt mikroskop. Ved hjælp af en vand-dypning linse giver således en meget bedre NA end en tør linse, og samtidig forhindre skudspidsen fra dehydrering under billedbehandling processen. Mens glycerin og olie linser har en endnu højere NA end vand linser, de kræver brug af et dækglas, hvilket er meget upraktisk med en prøve på størrelse med en skudspidsen, som også fortsætter med at vokse under tidsforskudt eksperimenter. Givet størrelsen af prøverne (afhængig af blomster stadier, kan stakke være over 150 um tyk), er det også vigtigt at anvende en linse med en lang arbejdsafstand. Vi bruger typisk en 20 eller 40X objektiv med en NA på 1 og en arbejdsafstand på 1,7-2,5 mm.
Konfokal mikroskop software tilbyder flere måder at visualisere konfokale data, herunder tredimensionelle rekonstruktioner (Figur 2, B1, B2 og B4) og udsigt skive (Figur 2, B3). Mens de mest almindeligt anvendte tredimensionale synspunkter er maksimale projektioner af konfokal Z-stakke (figur 2, B1 og B4), noget software intensitet (f.eks ZEN og Imaris) har også udsigt gennemsigtighed som filtrerer signalet fra de dybere dele af prøven (figur 2, B2), hvilket kan være nyttigt, når man ser på processer, der finder sted, eller gener udtrykt i det epidermale lag. Signalintensitet kan enten være kodet med en enkelt farve (figur 2, B1) ved anvendelse pixel intensity, eller under anvendelse af en farvekode (figur 2, B4).
Levende konfokal imaging tilbyder ikke kun værdifuld kvalitative indsigter i blomst udvikling, det også potentielt giver udviklingsmæssige biologer med et væld af kvantitative data. Forskellige software (f.eks Imaris, Fiji, MARS-ALT, MorphographX 15, 20, 21) giver mulighed for kvantificering af antallet eller volumenet af celler, der udtrykker et eller flere reportere, eller niveauet af ekspression af et reporter i forskellige celler. Sådan software kan også bruges til at udføre automatisk celle segmentering, spore cellelinjer og kvantificere vækst. Denne forskellige software tilbyder lignende værktøjer, men også adskiller sig på mange måder. MARS-ALT og MorphoGraphX blev designet specielt til planter 15, 20, 21, i modsætning Imaris ennd Fiji. MorphoGraphX kun tillader segmentering og analyse af det epidermale lag, mens Imaris og MARS-ALT muliggøre segmentering og analyse af hele prøven. Men MARS-ALT kræver forudgående billeddannelse af samme prøve fra tre forskellige vinkler 15, og Imaris kun kræver en enkelt stak. Adgang til kvantitative oplysninger er afgørende for at fremme vores forståelse af blomst udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Forfatteren vil gerne takke professor Elliot M. Meyerowitz for hans støtte, og kommentarer til manuskriptet, samt Ann Lavanway på Dartmouth College og Dr. Andres Collazo på Biologisk Imaging Facility på Caltech for deres hjælp til at løse tekniske problemer med den levende konfokal billeddannelse. Nathanaël Prunet arbejde er støttet af det amerikanske National Institutes of Health gennem Grant R01 GM104244 til Elliot M. Meyerowitz.
Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | Dumont Style 5 Inox, for apex dissection |
Pin Vise | Ted Pella, Inc. | 13560 | 80 cm long, for sepal ablation |
Straight Stainless Steel Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-50 | 0.1 mm Diameter, 1.2 cm long, for sepal ablation |
Round plastic boxes | Electron Microscopy Sciences | 64332 | transparent, 6 cm diameter, 2 cm deep, to use as dissecting dishes |
Rectangular hinged boxes | Durphy Packaging Co. | DG-0730 | transparent, 2-7/8” long, 2” wide, 1-1/4” deep, to use as imaging dishes with an upright microscope |
Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | VWR | 25382-064 | transparent, 3.5 cm diameter, 1 cm deep,to use as imaging dishes with an inverted microscope |
P10 and P1000 pipettes | with corresponding filter tips | ||
Stereomicroscope | with an 80-90 x maximum magnification | ||
Laser ablation system | for sepal ablation | ||
Laser scanning confocal microscope system | |||
20 or 40 x water-dipping lens | with a NA of 1 and a working distance of 1.7-2.5 mm | ||
Agarose | |||
Sucrose | |||
Murashige and Skoog basic salt mixture | Sigma-Aldrich | M5524 | without vitamins |
Myo-inositol | Sigma-Aldrich | I7508 | vitamin |
Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0761 | vitamin |
Pyridoxine hydrochloride | Sigma-Aldrich | P6280 | vitamin |
Thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T1270 | vitamin |
Glycine | Sigma-Aldrich | G8790 | vitamin |
N6-Benzyladenine | Sigma-Aldrich | B3408 | BAP, a cytokinin |
Propidium iodide solution | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL solution in water, to stain the cell walls |
FM4-64 | Invitrogen | F34653 | dilute in water to 80 μg/mL, to stain the plasma membranes |