Détermination de l&#39;échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l&#39;ADN Mesure Contenu

Yishai Yehuda; Britny Blumenfeld; Dan Lehmann; Itamar Simon

doi:10.3791/55157

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Article de méthode

Détermination de l'échelle du génome de Timing de réplication mammalienne par l'ADN Mesure Contenu

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DOI :

10.3791/55157

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19 janvier 2017

Yishai Yehuda¹ , Britny Blumenfeld¹ , Dan Lehmann² , Itamar Simon¹

¹Dept. of Microbiology and Molecular Genetics, IMRIC, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem, ²The Core Research Facility, IMRIC, Faculty of Medicine, Hebrew University of Jerusalem

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici une approche relativement rapide et simple pour cartographier le moment de la réplication des mammifères à l’échelle du génome, de l’isolement cellulaire à l’analyse de base des résultats de séquençage. Une carte génomique d’un programme de réplication représentatif sera fournie conformément au protocole.

Résumé

La réplication du génome se produit pendant la phase S du cycle cellulaire dans un processus hautement régulé qui assure la fidélité de la duplication de l'ADN. Chaque région génomique est répliqué à un moment distinct lors de la phase S par l'activation simultanée de multiples origines de réplication. Temps de réplication (TDR) est en corrélation avec de nombreuses caractéristiques génomiques et épigénétiques et est liée à des taux de mutation et le cancer. Comprendre la vue complète du génome du programme de réplication, de la santé et de la maladie est un objectif de l'avenir et un défi.

Cet article décrit en détail le "Rapport de copie Nombre de S / G1 pour la cartographie Temps génomique de réplication" méthode (appelée ici: CNR-TdR), une approche simple pour cartographier le génome large TdR de cellules de mammifères. La méthode est basée sur les différences de nombre de copies entre les cellules en phase S et les cellules en phase G1. La méthode CNR-TdR est effectué en 6 étapes: 1. Préparation des cellules et la coloration avec l'iodure de propidium (PI); 2. Sørting G1 et des cellules en phase S à l'aide de cellules activées par fluorescence (FACS); 3. purification d'ADN; 4. sonication; 5. préparation et séquençage Bibliothèque; et 6. L'analyse bioinformatique. La méthode CNR-TdR est une approche simple et rapide qui se traduit par des cartes de réplication détaillées.

Introduction

la réplication de l'ADN de mammifère est étroitement régulée pour garantir la réplication précise de chaque chromosome exactement une fois au cours du cycle cellulaire. La réplication se produit selon un ordre très réglementé - plusieurs grandes régions génomiques (~ Mb) répliquent au début de la phase S (réplication précoce des domaines) , tandis que d' autres régions génomiques reproduisent plus tard , au milieu ou en phase S tardive (milieu et fin répliquant les domaines) ^1. La majeure partie du génome réplicats en même temps dans tous les tissus (domaines TdR constitutifs), tandis que 30% - 50% du génome, change TdR entre les tissu....