Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии
Summary
Митохондрии могут использовать электрохимический потенциал через их внутреннюю мембрану (Δ фт) секвестр кальция (Ca 2+), что позволяет им формировать цитозольного Ca 2+ сигналов внутри клетки. Мы опишем метод для одновременного измерения митохондрий поглощения Са 2+ и ΔΨ м в живых клетках с использованием флуоресцентных красителей и конфокальной микроскопии.
Abstract
Помимо своей важной роли в создании АТФ, митохондрии также выступать в качестве местного кальция (Ca 2+) буферы плотно регулировать концентрацию внутриклеточного Ca 2+. Для этого, митохондрии используют электрохимический потенциал через их внутреннюю мембрану (ΔΨ м) секвестр Ca 2+. Приток Са 2+ в митохондрии стимулирует три ограничения скорости дегидрогеназ цикла лимонной кислоты, увеличивая перенос электронов через окислительное фосфорилирование (OXPHOS) комплексов. Эта стимуляция поддерживает Аф м, что временно рассеиваемой как положительные ионы кальция пересекают внутренней мембраны митохондрий в митохондриях.
Здесь мы опишем метод одновременного измерения митохондрий поглощения Са 2+ и ΔΨ м в живых клетках с использованием конфокальной микроскопии. По permeabilizing клеток, митохондриальных Ca 2+ можетбыть измерена с использованием флуоресцентного Са 2+ индикатора Fluo-4, AM, с измерением разориен- м с использованием тетраметилродамин флуоресцентный краситель, метиловый эфир, перхлорат (TMRM). Преимущество этой системы состоит в том , что существует очень мало спектральное перекрытие между флуоресцентных красителей, что позволяет точно измерять митохондриального Са 2+ и Аф м одновременно. Используя последовательное добавление Ca 2+ аликвот, митохондриальная Ca 2+ поглощение можно контролировать, и концентрация , при которой Са 2+ индуцирует митохондриальной переход проницаемость мембран и потеря Аф м определяется.
Introduction
Митохондрии играют важную роль в регуляции внутриклеточной концентрации Са 2+, выступая в качестве местных Са2 + буферов 1. Ca 2+ поступает в митохондрии через унипорт Ca 2+, процесс , приводимый электрохимического градиента , который существует по всей внутренней митохондриальной мембране (ΔΨ м) 2. Оказавшись внутри митохондриях, Ca 2+ может активировать окислительного фосфорилирования, стимулируя три ограничения скорости дегидрогеназ цикла лимонной кислоты 3. Эта стимуляция поддерживает Аф м, что временно рассеиваемой как положительные ионы кальция пересекают внутренней мембраны митохондрий в митохондриях. Если концентрация Са 2+ в митохондриях становится очень высокой, митохондриальная переход проницаемость может быть инициирована, что приводит к распылению разориен- м, то cessatioп окислительного фосфорилирования и индукция гибели клеток путей 4 передачи сигналов.
Важная роль, которую играют митохондрии в пространственной буферизации клеточного кальция делает точный мониторинг митохондриального кальция критическим. Различные методы были созданы для мониторинга митохондриальную кальция, в том числе с использованием красителей на основе родамина. Одним из таких красителей, Rhod-2, АМ, весьма эффективен при разбиении на митохондрии для измерения уровней митохондриальных 5 Ca 2+, 6. Однако необходимо использовать в качестве какой-то краситель будет накапливаться в других органеллах, таких как липосомы, или остаются в цитозоле клетки. Тем не менее, ниже по течению анализы могут быть использованы , чтобы отличить эти сигналы от тех , из митохондрий 7.
Другой метод для мониторинга митохондриальную кальций использует флуоресцентные репортер строит 8 </s вверх>. Польза от этих генетически кодируемых зондов является то, что они могут быть конкретно направлены на митохондрии с помощью эндогенные N-концевых пептидов, например, сигнал с N-концевым адресности человеческого ЦОГ-субъединицы VIII. Эта система была использована для создания митохондриальный-мишенью акворина зонд , который оказался чрезвычайно полезным для исследования митохондриальной кальция сигнализации 9. Главный недостаток этих генетически кодируемых зондов является то, что они должны быть введены в клетки путем временной экспрессии (что не представляется возможным для некоторых типов клеток, и может производить различные результаты), либо путем создания стабильных систем экспрессии (что отнимает много времени).
Для того, чтобы обойти проблемы , описанные выше, мы разработали новый протокол для измерения митохондриальную Са 2+ и Аф м одновременно. Этот протокол основан на методе, описанном ранее, который добавляет экзогенного кальция в клетках пермеабилизированныхs = "Xref"> 10. Наш протокол имеет три основных преимущества по сравнению с другими способами: во – первых, мы используем Fluo-4, AM и TMRM для мониторинга митохондриальную Са 2+ и Аф м, два красителей , которые имеют очень разные спектральные свойства; Во- вторых, клетки проницаемыми , так что сигнал Fluo-4 только обнаружение митохондриальных Ca 2+ и Ca 2+ не локализованы в других органеллах , или в цитозоль клеток; и в- третьих, использование Fluo-4 для обнаружения митохондриальных Ca 2+ позволяет быстро и просто окрашивания клеток, отрицающий любые трансфекции клеток или трансформации проблемы , которые существуют при использовании генетически кодируемых зондов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кальций играет важную роль во многих клеточных процессах, в том числе сокращение мышц, нервных клеток сигнализации и пролиферации клеток 13. Увеличение концентрации клеток кальция часто связаны с спроса на энергию, с кальцием , способного непосредственно стимулировать мит…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-ра Kirstin Elgass и д-р Сара Крида из Monash Micro Imaging, для оказания технической помощи, а также Wellcome Trust и Совет по медицинским исследованиям Великобритании за финансовую поддержку. MMcK поддерживается будущее стипендий схема австралийского совета по научным исследованиям (FT120100459), Бакланд Фонд Уильяма, Австралийский фонд митохондриального заболевания (AMDF), Института Хадсона медицинских исследований и Университета Монаша. Эта работа была поддержана Викторианский правительства Схемы операционной инфраструктуры поддержки.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 10566016 |
| fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher | 16000044 |
| 1x phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 |
| 100x penicillin/streptomycin (p/s) | ThermoFisher | 15140122 |
| 0.25% Trypsin / 0.25% EDTA | ThermoFisher | 25200056 |
| 8-well chambered coverslip | ibidi | 80826 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 746452 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 746495 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2670 |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 |
| HEDTA | Sigma-Aldrich | H8126 |
| malate | Sigma-Aldrich | M1000 |
| glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 |
| Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS) | ThermoFisher | 14175-095 |
| tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM) | ThermoFisher | T668 |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
| Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM) | ThermoFisher | F14201 |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | ThermoFisher | D12345 |
| carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 |
| digitonin | Sigma-Aldrich | D141 |
| thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher | P3000MP |
| hemacytometer | VWR | 631-0925 |
| 10 cm cell culture dishes | Corning | COR430167 |
| 75 cm2 cell culture flasks | Corning | COR430641 |
References
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling. Physiology. 23, 84-94 (2008).
- Jacobson, J., Duchen, M. R. Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling. Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).
- Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).
- Duchen, M. R. Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).
- Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus. J. Physiol. 522, 375-390 (2000).
- Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell. 82, 415-424 (1995).
- Davidson, S. M., Duchen, M. R. Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy. Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).
- Pozzan, T., Rudolf, R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).
- Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. BioTechniques. 12, 870-879 (1992).
- McKenzie, M., Duchen, M. R. Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids. PLoS One. 11, e0154371 (2016).
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein. J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).
- Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. . 2. n. d. Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).
- Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration. Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).
