Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Summary

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ _Ψm) pour séquestrer le calcium ^{(Ca2 +),} ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique ²⁺ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries ^{Ca2 +} d'absorption et ΔΨ _m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

Abstract

En dehors de leur rôle essentiel dans la création de l' ATP, les mitochondries jouent également le rôle du calcium local ^{(Ca2 +)} tampons à bien réguler la concentration intracellulaire de ^{Ca2 +.} Pour ce faire, les mitochondries utilisent le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (ΔΨ _m) pour séquestrer le Ca ^2+. L'afflux de ^{Ca2 +} dans les mitochondries stimule trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique, ce qui augmente le transfert d'électrons à travers la phosphorylation oxydative (OXPHOS) complexes. Cette stimulation maintient ΔΨ _m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale.

Nous décrivons ici une méthode pour les mitochondries de mesure simultanément Ca ²⁺ d'absorption et ΔΨ _m dans les cellules vivantes en utilisant la microscopie confocale. En perméabilisant les cellules, Ca ²⁺ mitochondrial peutmesurer à l' aide de Ca ²⁺ indicateur fluorescent Fluo-4 AM, avec mesure de ΔΨ _m à l' aide du colorant fluorescent tétraméthylrhodamine, l' ester méthylique, le perchlorate (TMRM). L'avantage de ce système est qu'il existe très peu de chevauchement spectral entre les colorants fluorescents, ce qui permet simultanément une mesure précise de la mitochondrie Ca ²⁺ et ΔΨ _m. En utilisant l'addition séquentielle d'aliquotes de Ca ^2+, Ca ²⁺ absorption mitochondriale peut être contrôlée, et la concentration à laquelle ^{Ca2 +} mitochondrial induit une transition de perméabilité de la membrane et la perte de _m ΔΨ déterminée.

Introduction

Les mitochondries jouent un rôle important dans la régulation de la concentration intracellulaire de ^{Ca2 +} en agissant comme locaux Ca ²⁺ tampons ^1. Ca ²⁺ entre les mitochondries via le uniport Ca ^2+, un processus piloté par le gradient électrochimique qui existe à travers la membrane mitochondriale interne (ΔΨ _m) ^2. Une fois dans la matrice mitochondriale, Ca ²⁺ peut activer la phosphorylation oxydative en stimulant trois déshydrogénases limitant la vitesse du cycle de l' acide citrique ^3. Cette stimulation maintient ΔΨ _m, qui est temporairement dissipée sous les ions calcium positifs traversent la membrane mitochondriale interne dans la matrice mitochondriale. Si la concentration de ^{Ca2 +} dans les mitochondries devient très élevée, la transition de perméabilité mitochondriale peut être déclenchée, entraînant la dissipation de ΔΨ _m, la cessation de la phosphorylation oxydative et l'induction de la mort cellulaire des voies de signalisation ^4.

Le rôle important que jouent les mitochondries dans la mémoire tampon spatiale du calcium cellulaire rend le contrôle précis du calcium mitochondrial critique. Diverses méthodes ont été mis en place pour surveiller le calcium mitochondrial, y compris l'utilisation de colorants à base de rhodamine. Un tel colorant, Rhod-2, AM, est très efficace au partitionnement des mitochondries pour mesurer mitochondriales niveaux de ^{Ca2 + 5, 6.} Cependant, les soins doit être utilisé comme certains colorants accumulera dans d'autres organites, tels que les liposomes, ou de rester dans le cytosol des cellules. Cependant, des analyses en aval peuvent être utilisés pour distinguer ces signaux de ceux de la mitochondrie ^7.

Une autre technique pour surveiller le calcium mitochondrial utilise rapporteur fluorescent construit ⁸ </s up>. L'avantage de ces sondes codées génétiquement est qu'ils peuvent être spécifiquement ciblé vers les mitochondries en utilisant des peptides endogènes N-terminal, par exemple le signal de ciblage N-terminal de la sous-unité VIII de la COX humaine. Ce système a été utilisé pour générer une sonde aequorine mitochondriale ciblée qui a révélé extrêmement utile pour étudier le calcium mitochondrial de signalisation ^9. Le principal inconvénient de ces sondes codées génétiquement est qu'ils doivent être introduits dans les cellules par l'expression transitoire (ce qui est impossible pour certains types de cellules et peuvent produire des résultats variables) ou en créant des systèmes d'expression stables (qui prend du temps).

Pour contourner les problèmes décrits ci – dessus, nous avons développé un nouveau protocole pour mesurer mitochondrial Ca ²⁺ et ΔΨ _m simultanément. Ce protocole est basé sur une méthode décrite précédemment qui ajoute du calcium exogène à des cellules perméabiliséess = "xref"> 10. Notre protocole a trois principaux avantages par rapport aux autres méthodes: tout d' abord, nous utilisons Fluo-4, AM et TMRM pour surveiller Ca ²⁺ et mitochondrial ΔΨ _m, deux colorants qui ont des propriétés spectrales très distinctes; d' autre part, les cellules sont perméabilisées afin que le signal Fluo-4 est seulement détecter mitochondrial Ca2 ⁺ et ^{Ca2 +} non localisé à d' autres organelles ou dans le cytosol des cellules; et troisièmement, l'utilisation de Fluo-4 pour détecter Ca ²⁺ mitochondrial permet de coloration cellulaire simple et rapide, éliminant tous les problèmes de transfection ou de transformation cellulaire qui existent si l'on utilise des sondes codées génétiquement.

Protocol

1. Préparation des cellules Cultiver les cellules sur 10 cm des boîtes de culture cellulaire ou flacons de 75 cm2 dans les milieux de culture [10 ml Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco supplémenté avec 5% (v / v) de sérum de veau fœtal (FBS) et 1x pénicilline / streptomycine (p / s )] à 37 ° C / 5% de CO 2. Pour récolter les cellules, retirer le support par aspiration, puis laver avec 5 ml 1x tampon phosphate salin (PBS 1x). Retirer PBS 1x par aspiration, puis ajouter 1…

Representative Results

Nous avons utilisé ce protocole pour examiner les effets d'une mutation MT-ND5 sur la capacité des mitochondries des cellules 143B au tampon augmente en calcium 12. Dans l'exemple représenté ici, les cellules 143B de commande ont été chargées avec Fluo-TMRM et 4, AM avant de perméabilisation à la digitonine. Après 5 min d'imagerie, huit additions séquentielles d'une dilution 1: 100 de 40 mM de CaCl 2 exogènes ont ét…

Discussion

Le calcium joue un rôle important dans de nombreux processus cellulaires, y compris la contraction musculaire, la signalisation neuronale et la prolifération cellulaire ^13. L' augmentation des concentrations de calcium cellulaire sont souvent associés à la demande d'énergie, avec le calcium capable de stimuler directement la phosphorylation oxydative mitochondriale pour augmenter la génération d' ATP ^3. Il est donc essentiel que nous avons la capacité d…

Materials

Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher	10566016
fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher	16000044
1x phosphate buffered saline (PBS)	ThermoFisher	10010023
100x penicillin/streptomycin (p/s)	ThermoFisher	15140122
0.25% Trypsin / 0.25% EDTA	ThermoFisher	25200056
8-well chambered coverslip	ibidi	80826
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgSO4	Sigma-Aldrich	746452
KH2PO4	Sigma-Aldrich	795488
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270
CaCl2	Sigma-Aldrich	746495
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
HEDTA	Sigma-Aldrich	H8126
malate	Sigma-Aldrich	M1000
glutamate	Sigma-Aldrich	G1626
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
Ca2+ free Hank’s buffered salt solution (HBSS)	ThermoFisher	14175-095
tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM)	ThermoFisher	T668
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629
Fluo-4 acetoxymethyl ester (Fluo-4, AM)	ThermoFisher	F14201
dimethyl sulfoxide (DMSO)	ThermoFisher	D12345
carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
digitonin	Sigma-Aldrich	D141
thapsigargin	Sigma-Aldrich	T9033
Pluronic F-127	ThermoFisher	P3000MP
hemacytometer	VWR	631-0925
10 cm cell culture dishes	Corning	COR430167
75 cm2 cell culture flasks	Corning	COR430641