Summary
מחקר זה כלל שיטות לחשוף תופעות על שורת דגי המודל הבאה שינוי בהרכב קהילות Microbiome עור בטן באמצעות אנטיביוטיקה.
Introduction
זה כבר נקבע כי אנטיביוטיקה יכולה לשבש את Microbiome האדם שמוביל dysbiosis, כלומר חוסר איזון קהילת חיידקים. שינוי ההלחנה של החיידקים לאחר טיפול אנטיביוטי הוכח להפחית את המגוון של הקהילה, להפחית אנשי מפתח, וכן לשנות את חילוף חומרי קהילה, במיוחד במעיים 1, 2. הפרעה אנטיביוטיה של Microbiome הבטן יכולה להפחית התנגדות קולוניזציה כדי Clostridium difficile 3, 4 ו סלמונלה 5.
בנוסף, השיבוש של החיידקים נקשר להתפתחות רבות תסמונות ומחלות בבני אדם (למשל, אנטיביוטיקה הקשורים enterocolitis, מחלות מעי דלקתיות, מחלות מטבוליות, וכו.). אנטיביוטיקה גם מיושמת נרחבת בחקלאות כמו מקדמי צמיחה בייצור בעלי חיים ועופות 6. השימוש של כלים רבי עוצמה אלה אינו נטול תופעות בטחונות, אשר בא לידי ביטוי בעלייה מהירה של עמידות לאנטיביוטיקה, כמו גם את ההשפעות של Microbiome שיבשו יש עם המארח מאוכלס שלה. מחקרים רבים הראו כי שימוש באנטיביוטיקה רחב טווח יש ארוכת השלכות קיימא המבנה והתפקוד של החיידקים, אך תופעות הלוואי מן הפיסיולוגיה מארח להשפיע לאנטיביוטיקה שבשה Microbiome הם ספקולציות בלבד שטרם להיתמך.
משחק הגומלין בין מארחת, חיידקים, ואנטיביוטיקה הוא רחוק מלהיות מובן בצורה תמציתית. לכן, מודל פשוט יותר צייתן יתרון שפיכת אור על מערכת יונקים המורכבת ביותר. משטחים ריריים בבני אדם, כולל הבטן, נמל הצפיפות והמגוון ביותר של חיידקים, וגם אינטראקציות חיידק המארח האינטימיות ביותר. Microbiome העור הרירי של ים הצעות דגיםיתרונות everal כמערכת מודל. כליל הגרמי (הדגים גרמיים) הוא אחת השושלות המוקדמות לסטות כמשמעותו החוליות שיש teleosts הוא המולד רכשה מערכת חיסונית כי יש שיתוף התפתח יחסים עם קהילות חיידקי commensal 7. מניות עור דגי מאפיינים רבים עם משטחים ריריים סוג 1 של יונקים, כגון תפקודים גופניים, רכיבים חסינים ועל ארגונו של תאים מייצרי ליחה 8. המיקום החיצוני של משטח עור דג הרירי מציע Microbiome קל לתפעל מדגם הניסיון.
גמבוזיה מצויה המערבי, affinis Gambusia (ג affinis), הוא דג מודל, שבו נעשה שימוש בעבר ללימוד ההזדווגות ואת הרעלים 9, 10, 11. בהתחשב בגודל הקטן, שפע אוכלוסייה בטבע כמו מין פולש, מ ' טיפול עלות inimal, והטבע הארדי, פתחנו ג affinis כמודל Microbiome רירי. יתר על כן, Gambusia לשתף הפיזיולוגיה של הלידה לחיות צעירים עם יונקים היולדת צאצאים חיים, שהוא נדיר ב מיני דגים. אנחנו השלמנו את המחקר המקיף ביותר בעת חיידקים נורמלים עור דג באמצעות 16S פרופיל עם Gambusia 12. עבודה נוספת הפגינו שלוש השפעות שליליות על למארח הבא שיבוש של החיידקים בעור הבטן באמצעות 13 אנטיביוטיקה רחבת טווח.
חמישה אפקטים שונים נבחנו הדג לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה. היתרון המארח ביותר שהוקם היטב של Microbiome הוא הרחקה תחרותית של פתוגנים. Ictaluri דגים הפתוגן Edwardsiella ידוע כגורם התפרצויות של הרעלת דם מעיים בחוות שפמנון מסחרי 14. גם א ictaluri הוכח קטלני להדביק דג זברהclass = "Xref"> 15, 16 ו Gambusia 17. אתגר עם הפתוגן מעמודת המים יכול לשמש כאמצעי של דרה. לשם השוואה כדי רגישות פתוגן פרט, ההישרדות במהלך חשיפת צפיפות גבוהה של אורגניזמים מעורבים גם בוצעה. צואה ואדמה אורגני עשיר שימשו כמקורות-בדרך נתקל של קהילות מיקרוביאלי.
תפקיד נוסף נוסד קהילת בטן חיידקי המבצעת הנו קציר עיבוד אנרגיה מזין, ובכך להשפיע על הספיגה תזונתית הכוללת עבור המארחת. כתוצאת מדידת ברוטו של תזונה, משקל גוף דגים הושווה לפני ואחרי חודש אחד של שהאכיל תזונה סטנדרטית. אנטיביוטי שטופל דגים כממוצעים ירד במשקל בעוד דגים מלאים בממוצע עלו במשקל במהלך החודש. המנגנון זה חוסר העלייה במשקל אינו ברור. אחת גורם תורם אפשרי הוא זמן המעבר של המזון במעי. מוטי GIשיטת lity הותאם מתוך דג הזברה (אדם עשיר, SUNY Brockport, תקשורת אישית) כדי לקבוע את זמן המעבר. זה טרם נקבע אם דגים שטופל באנטיביוטיקה יש זמן מעבר שינה.
אתגר משותף חווה בסביבה הטבעית על ידי כל היצורים, במיוחד הדגים, הוא מתח האוסמוטי. Gambusia הוכחו לאמץ במהירות בחריפות הדגיש בריכוזים גבוהים של מליחות 18. באופן מפתיע, דגים עם Microbiome לאנטיביוטיקה שינתה הציג וריד הישרדות על מתח מלח גבוה. מנגנון פנוטיפ הרומן הזה נמצא תחת חקירה. עוד מתח משותף על בעלי חיים ימיים, במיוחד באקווריומים, הוא צורות רעילות של חנקן (אמוניה, ניטראט, ו ניטריט). הישרדות נגד חנקתי לא היה שונה משמעותית בין דגים אנטיביוטי שטופלו ושליטה. השיטות שהוצגו בכתב היד הזה יכול לשמש עם אורגניזמים Gambusia או מודל דגים דומים, כגון זברהדגים medaka, למדוד פנוטיפים בדגים הבאים מניפולציה ניסויית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו תחת אישור פרוטוקולים IACUC, ממוספרים 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, ו 14-04-17-1018-3-01.
1. איסוף בעלי החיים, טיפול וטיפול אתי
- אסוף Gambusia affinis מאתר שדה (מדריך זיהוי ב http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) באמצעות רשת מטבל קטנה ומניחים ל -19 דליים L. השתמש בדיקה ויזואלית לזהות מינים.
- דגים ופנאי 1 - 2 ד בתוך דלי עם מים בבריכה. לאחר מכן, להעביר דגים לתוך טנקי אקווריום L 76 או 189 מלאי מי ברכה חצי / חצי מים ברז של 25 מעלות צלזיוס, סודה עם מבעבעת airstone. השתמש נטו בגומחה קטנה בעת טיפול דג באשר מינימלית להפריע Microbiome עורם.
הערה: צפיפות דגים צריכה להיות לא יותר מ -20 דגים / 38 ליטר של מים באקווריום. דגים הם יתרגלו לאקווריום לפחות 5 ד לפני ניסויים. - להאכיל את הדגים על משטר יומי עם 5 מ"ג של מזון פתית לכל דגים. הודגי ld עם מחזור ח אור / 12 שעות כהה 12.
חשיפה 2. אנטיביוטי ראשוני עבור כל הניסויים
- ציור כל הדגים כל ניסוי מאותו אקווריום, למקם לשתי קבוצות נפרדות (מטופלים: נחשף אנטיביוטי ובקרה: שלא נחשפו) ב 19 דליים L. נתונים קודמים שנאספו עולה כי הדגים באותו אקווריום יש הומוגני microbiomes העור שיש וריאציה מעט בהרכב הקהילה. 12
- במהלך הניסויים, לשמור על הדגים ב 2 ליטר מים אגם מלאכותי (APW; 0.33 g / L CaCl 2, 0.33 גר '/ ל MgSO 4, 0.19 גר' / ל NaHCO 3) כי מעוקר על ידי מעוקר לפני השימוש.
- הכן פתרון המניות אנטיביוטי ריפמפיצין ידי הוספת 50 מ"ג / מ"ל לתוך sulfoxide דימתיל (DMSO). ריפמפיצין הוא אנטיביוטי רחב ספקטרום נציג כי אינו רעיל לדגים. אצל בני אדם ועכברים, היא מפיצה גם ברקמות.
- מתוך מניות ריפמפיצין לנהל סופיריכוז של 25 מיקרוגרם / מ"ל ב 2 ליטר של APW לחשיפה אנטיביוטיקה מקבוצת דגים שטופלו במשך 3 ימים. שים לב שלאחר 3 ד, מספרי חיידקי עור culturable לחזור דומים לזו של עור דגי pretreated.
- במקביל, לשמור קבוצה של דגים שלא טופלו ב APW ולתת כמות שווה של DMSO (0.5 מ"ל לכל ליטר של APW) לתוך עמודת המים לפעול כקבוצת ביקורת.
- ככל שניסויים נועדו למדוד תופעות של Microbiome לאנטיביוטיקה שינתה על פנוטיפים דגים, כדי למנוע תופעות ישירות האנטיביוטיקה עוצמה, בעקבות החשיפה האנטיביוטיה של שלושה ימים (או שליטה) תקופה, העברת הדגים לדלי עם 2 ליטר APW הטרי.
- השתמש תקופת מנוחה של 10 שעות ולכן האנטיביוטיקה הוסרה על ידי הגופים של הדג. מאגר זמן חיסול זה על ניסויים בהם דגים נחשפו 25 מיקרוגרם / מ"ל של אנטיביוטיקה למשך שלושה ימים. להרדים את הדגים על ידי לגזום את חוט השדרה ואחריו pithing, אז homogenize הגוף כולו באמצעות מטחנת רקמות.
- לקבוע נוכחות אנטיביוטי על ידי הצבת 50 μL של השעיה זו לאחר 0.2 מיקרומטר סינון למרכז צלחת פטרי אגר. עושים חור להשעיה זאת על ידי לחיצה הפוכה קצה פיפטה סטרילית 200 μL לתוך אגר, אשר מסיר תקע קטן.
- השתמש צלחות אגר עם 20 נפח נמדד מ"ל של אגר מזין, להתפשט באופן שווה באמצעות מקלון צמר גפן עם אורגניזם מחוון, subtilis Bacillus, שהוא רגיש ריפמפיצין. השג את 'subtilis מתוך אגר מזין וטופחו על 25 ° CO / N ושימוש המקלון להשיג מושבה. התבוננות אזור של עיכוב לאחר דגירה לילה בשעה 25 ° C מציין נוכחות של אנטיביוטיקה ברקמות הדגים.
3. הפקת Microbiome
- חלץ מדגם העור Microbiome מן האפידרמיס הרירית החיצונית על ידי הנחת דגים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל סטרילי מלאים 2 מ"ל סטרילי PBST (137 מ"מ NaCl, 10 פוספט מ"מ, 0.1% Tween-20, pH 7.4) פתרון vortexing בכל הגדרה של 10 דקות 1 עם במרווחים שהשהיה של 10. דטרגנט ומלח למאגר מקדם אפילו פיזור של חיידקים בתמיסה. תוצאות דומות נמצאו עם מי מלח 0.85% אך גרמו לספירות חיידקים עם מים טהורים.
- מעביר את הדג מצינור החרוטים כדי דלי התאוששות. הקטלניות של מיצוי העור הוא בדרך כלל נמוך מ -10%. כך או, לנתח את ההשעיה חיידקי בצינור מיד עם למיצוי או גלולה חיידקים על ידי ספין 2 דקות בצנטריפוגה בטמפרטורת החדר ב 15,000 XG ולאחסן ב -80 ° C לצורך ניתוח עתידי.
הערה: כל תרבות ניתוחי ביוכימיים הן מיידיות; DNA או מיצוי חלבון יכול להיות ממדגמים קפוא. - כדי להשיג מדגם Microbiome בטן, מקום ראשון הדג בצלחת פטרי סטרילית. להרדים את הדגים על ידי ניתוק חוט השדרה הצווארי ישירות מאחורי הראש עם מספריים כירורגיות, ואחריו pithing, ולאחר מכן חיצוני לטהר את הגוף עם מגבונים אתנול 70%.
- לאחר דיסקציה, להסיר את הבטן כולה על ידי חיתוך לאחר הוושט ולפני פי הטבעת.
- חותכים את המעיים למקטעים קטנים 1 - 2 מ"מ אורך ולמקם את כל החלקים לשתי פתרון מ"ל PBST צינור חרוטי. לאחר vortexing דקות 1, להסיר supernatant לתוך צינור נקי אחר (לנקוט זהירות כדי לא למשוך את חלקי מעי).
הערה: Supernatant מכיל חילוץ חיידקי מעיים שיכולים לשמש גם עבור ניתוחים ישירים או pelleted ידי השיטה הקודמת ציינה עבור דגימות עור.
זיהום 4. הכנת מודל אמבט של פתוגן ספציפי
- השג זן זיהומיות של Edwardsiella ictaluri (א ictaluri) ולשמור את התרבות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. הזנים 93 - 146 השתמשו במחקר זה, מבודד מן שפמנון נגועים, התקבל מארק לורנס, המכללה לרפואה וטרינרית, אוניברסיטת מיסיסיפי סטייט.
- streak א במלאי ictaluri על גבי מדיה סלקטיבית & ההפרש נקרא התקשורת ictaluri א (EIM) אגר 19 לתרבת את החיידקים דגירה במשך 2 ד ב 27 מעלות צלזיוס.
- העבר מושבה מבודדת טהור מן התרבות לחסן בבקבוק 150 מ"ל המכיל 40 מ"ל של מרק מזין (NB; 5 גר '/ ל peptone, 4 גר' / ל תמצית בשר בקר). בקבוק מקום שייקר להגדיר ב 150 סל"ד במשך 2 ד ב 27 מעלות צלזיוס.
- לאחר דגירה, לדלל מדגם של התרבות PBST לקריאה ספקטרומטר של 0.2 OD ב 650 ננומטר לכייל E. תרבות ictaluri עבור כרכי מנת זיהומיות רצויות.
- ההעברה הבאה מטופלים הן (אחרי 3 ד חשיפה לאנטיביוטיקה) וקבוצות דגי מטופל לכוסות פלסטיק בודדות המכילות 130 מיליליטר של מי אגם מלאכותיים טריים, או APW במשך כ -10 שעות לקבלת אישור תרופה מרקמות דג.
- ואז משתי הקבוצות, להעביר שוב כל הדגים לתוך 8-אונקיה כוסות פלסטיק המכיל 130 מ"ל של APW נקי. תן לכל דגי מנה קטלנית המכילה 2.8 x 10 6 CFU / מיליליטר של תרבות ictaluri E. לתוך APW (מודל זיהום אמבטיה) ולשמור C חממת 27 מעלות במשך 24 שעות.
- לאחר אמבטית א ictaluri, להעביר דג בנפרד לתוך כוסות חדשות עם 130 מיליליטר של APW.
- בעקבות החלפת מים, תמותת דגים שיא על משך שבוע. דגים הם לא נמאסו על פני תקופה זו. בניגוד שפמנון, Gambusia להראות שום סימנים חיצוניים של זיהום, ולכן חיוני להשתמש קטלני נקודת סיום ניסיונית.
5. אתגר polymicrobial עם צואה & קרקע
- טיפול צואה
- השג צואת אדם טרי מנושא מתנדבים בריאים אשר לא קיבלו טיפול אנטיביוטי בשבועיים הקודמים, באמצעות כפפות סטריליות צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.
- עם הגבייה, לאסוף צואה בשקית פלסטיק סטרילית ולאחר מכן להעביר לתוך ג 15 מיליליטר סטריליצינור onical. צור ריכוז המניות על ידי השעיית צואה ב PBST לתת פתרון המניות של 500 - 800 מ"ג / מ"ל. תערובת עבה זה עדיף להעביר באמצעות 1 מ"ל או קצה פיפטה פלסטיק גדול שנחתך בתחתית במספריים סטריליות כך פתח גדול.
- לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה ראשונית של מטופלים ולשלוט קבוצות דגי מטופל, להפריד לתוך כוסות פלסטיק בודדות המכילות השעיה צואתי בריכוזים סופיים של כל אחד 15 מ"ג / מיליליטר או 10 מ"ג / מיליליטר לתוך APW בהיקף כולל של 130 מיליליטר. החזק כוסות באינקובטור ב 25 מעלות צלזיוס.
- שיא תמותה דגה במהלך חשיפת צואה על ידי השגחה צמודה מעל 2 ד.
- טיפול קרקע
- אסוף 1 - 2 קילו של שכבת קרקע עליונה עשירה אורגנית (אמור להכיל את הצפיפות והמגוון ביותר של חיידקים) כ 7 - 15 סנטימטר למטה לעומק ומקום לתוך מיכל פלסטיק נקי. ראוי לציין, כי האדמה צריכה לשמש בתוך יומיים לאחר איסוף.
- נוֹרָאctly לאחר תקופת החשיפה הראשונית, להפריד בשתי הקבוצות של אנטיביוטיקה שטופלו ודגים מטופל לכוסות פלסטיק בודדים המכיל 18.2 גרם של אדמה ב -130 מ"ל של APW. מערבבים את הקרקע בבאר מים ביד לפני הוספת הדגים. רוב החלקיקים לא להשעות ולהישאר בתחתית הכוס.
- לחשוף דגים למשך תקופה של 3 ד של 25 מעלות צלזיוס ולהקליט כל תמותה.
6. אתגר מתח אוסמוטי
- לאחר הטיפול ואחריו תקופה של 10 שעות מנוחה כמתואר לעיל, לייחד דגים לתוך כוסות נפרד המכיל NaCl ב 17.5 מ"ג / מ"ל (300 מ"מ) ב 150 מ"ל של APW. זוהי מחצית המליחות הטיפוסית של מי ים, אשר אינה קטלנית מלא (<50%) כדי לשלוט דגים אבל הוא מלחיץ מאוד, מחייב ויסות האוסמוטי יעילה.
- שים לב לתמותת דגים במשך זמן של 36 שעות.
אתגר 7. ניטרט רעילים
- דגים ויתרה לתקופת 10 שעות לאחר יישום רעיון אנטיביוטייור, ולאחר מכן דגים נפרד לתוך מנות אישיות המכיל ריכוז נתרן חנקתי של או 10 מ"ג / מ"ל (118 מ"מ) או 17.5 מ"ג / מ"ל (206 מ"מ) ב 130 מ"ל של APW.
- שיא לתמותה מעל 4 ד עבור במינון נמוך ו 1 ד עבור במינון גבוה.
8. ניתוח צמיחה של דגים פרטניים או בקבוצות
- 3 ד אנטיביוטי חשיפה או שליטה מלאה לתקופה כקבוצות בדליים.
- לאדם, למלא כוסות קלקר 8-עוז עם 150 מ"ל APW כל, להעביר דגים בודדים לתוך כוס ולהקליט משקל הגוף הכולל הערכה ראשונית.
- חזור על הפעולה עבור כל הדגים בשתי הקבוצות שטופלו ומטופלים כראוי. השתמש בכוסות קלקר לבנות במקום כוסות פלסטיק שקופים כי דגים לא לאכול כאשר בספלים הברורים.
- להאכיל את הדגים יומיים עם התזונה הסטנדרטית של שני כדורים לכל דגים. פלטות שמשו ולא פתיתי כי יש כדורים שונות נמוכות במסת בודדים (3.53 ± 0.42 מ"ג כל אחד, או 8 וריאצית%), resulting בדגי קבלת כמויות דומות של מזון. באפשרותך לפקח על צריכה ידי הקלטה כדורית שלא נאכל חזותי. שיעורי הצריכה היו בדרך כלל מעל 80%.
- בסוף כל שבוע במשך 4 שבועות, לקבוע משקל דגים. הכין כוס חדשה עם APW הטרי, למקם על איזון, ולאחר מכן לרשום את המשקל. לאחר מכן, לשפוך דג לתוך נטו מטבל מהגביע המקורי ולהעביר לתוך הכוס החדשה, אשר לאחר מכן נשקלה שוב. דגים אינם מטופלים, כדי למנוע לחץ.
- עבור קבוצות, מקום 2 ליטר של APW לדלי 19 L טרה הסקאלה. יש לשמור את הדגים יחד בשני הקבוצות בעת ההעברה לסלי APW חדשים ואז להקליט משקל קבוצה כולל. קבוצת דגי שיא משקל בכל שבוע במהלך פרק זמן חודש באמצעות העברה דלי חדש.
9. גוט Transit זמן
- השתמש 70 kDa dextran anionic שכותרתו והעמסה. Dextran אינו מתעכל באופן משמעותי, והוא גדול מכדי להיקלט על פני שכבת המעיים, ובכך מעבר ימדוד את זמן המעבר במעי.dextran שכותרתו שולב מזון לדגים.
- לתוך צינור 1.7 מ"ל סטרילי, להוסיף 360 μL של מים סטריליים deionized ו -52 מ"ג של ג'לטין (פתרון 13%), ובמקום הצינור על גוש חום 60 מעלות צלזיוס עד נמס ג'לטין נמס לגמרי.
- פתיתי מזון דגי זהב טוחנות לאבקה דקה בעזרת מכתש ועלי, ולהוסיף 40 מ"ג של אבקה זו אל הצינור, יחד עם 20 μL של שמן דגים. לאחר ערבוב, להוסיף 1.6 מ"ג-dextran FITC.
- מחלקים את תערובת נוזל חם לתוך 20 μL טיפות על Parafilm על הספסל המעבדה, ולתת להם מגניב במהירות לחזק. טיפות ניתן לאחסן עד 4 ד לפני שהן הופכות קשות מדי לדגים לאכול. חנות טיפות במקרר ידי הצבת Parafilm על מחצית בצלחת פטרי, אשר צף אז על מים סטריליים בתוך במיכל פלסטיק אטום, אשר שומר את טיפות humidified.
- רגע לפני ההאכלה, ברבעון טיפות למקטעים באמצעות סכין גילוח. לאקלם את הדג בכוס הקפהכוסות קצף בנפרד עבור 2 ימים ללא האכלה (הערה: דגים מלאים שלא נחשפו רק שמשו). מניחים ארבעה רבעונים של מזון לתוך כוס עם הדגים, ולבחון את הדג במשך 30 דקות עבור חתיכות כמה האוכל שהם כל לאכול.
- כדי להתחיל בתקופת המעקב, להעביר דג בנפרד לתוך כוסות עם 80 מ"ל של APW באמצעות רשת לטבול. כל 2 שעות, בעדינות מערבולת APW ביד, ולאחר מכן לקחת דגימה מ"ל 1 ולאחסן צינור שכותרתו 1.7 מ"ל ב 4 מעלות צלזיוס. קח דגימות במשך 36 שעות.
- קרינת שיא, עם ספקטרופוטומטר קרינה, של כל הדגימות בעת ובעונה אחת לאחר השלמת assay. מניחים את המדגם 1 מ"ל כולו לתוך קובט, ולהקליט את הקרינה נמדדת באמצעות עירור ב 495 ננומטר פליטה ב 520 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דיאגרמה סכמטית הכוללת של המערכת הניסיונית בשימוש ללמוד תופעות מארח דגים מחשיפה אנטיביוטיה 13 מיוצגת באיור 1A וכוללת את הטכניקה לחילוץ העור (האיור 1B) ובמעיים (תרשים 1C) microbiomes מהדג. שלושה ימים נבחרה כתקופת אנטיביוטי החשיפה כי הנתונים הקודמים מגלה כי בעוד המספר הכולל העור culturable טיפות מוקדם בטיפול, זה חזר לטיפול מקדים רמות אחרי 3 ד. בינתיים, רכב הקהילה, כפי שנקבע על ידי פרופיל 16S, השתנה מאוד. לכן, בתקופה של 3 הימים צריכה להיות אופטימלית לניתוח ההשפעות מקהילים שונה של בערך באותו הצפיפות. שים לב ניתוח התרבות, באמצעות מספרי מושבה על צלחות אגרו, עשוי לעזוב את מספר המינים. יעילות שיטת פיזור העור Microbiome (איור 1B 4 - 10 משקל דגים 5 CFU / g) למספר מושבה מכמה דגים לפי אותו נוהל ההשעיה אותו בשנית (לכמת כל נותרים בַּקטֶרִיָה). ספירה מן ההשעיה שנייה הייתה נמוכים מ -100 CFU / g, דבר המצביע על שיטת ההשעיה היא אפקטיבית (לא פורסם).
דגים עם Microbiome לאנטיביוטיקה שינה הופיעו להיות רגיש יותר לזיהום א ictaluri מאשר דגים מלאים (איור 2). ההבדל בינתיים למוות של 56.1 ± 15 שעות לדגי מטופלי 98.5 ± 48 שעות לדגי בקרה לא היה מובהק סטטיסטי (שני זנב מבחן t, p = 0.12). זהו ככל הנראה בשל גודל הקבוצה הקטן (שטופל n = 6, השליטה n = 5). בגדלי קבוצה של לפחות תריסר ולכן מומלצים. היתרון של מודל זה זיהום הוא בפרוטוקול ATH, אשר אינו דורש מחטים עבור זיהום או מעקב של צריכת מזון. א ictaluri פולש שפמנון באופן טבעי מתוך עמודת המים. בטיחות היא גבוהה כי א ictaluri היא טמפרטורה רגישה, ובכך גרוע זיהומיות לבני אדם. מחקרים אחרים חשפו כי הזמן למות ג affinis בקורלציה עם המינון הראשוני של חיידקים. טמפרטורת הדגירה של 27 מעלות צלזיוס נבחרה אופטימלי לשני חיידקים ודגים.
מטופלים או דגי ביקורת לא נמצאו הבדלים משמעותיים בהישרדות במים מזוהמים עם ספירה גבוהה של חיידקים מעורבים. אין תמותה נצפתה מעל 4 ימים עבור הביקורת (n = 8) או מטופלים (n = 9) דגים כאשר הקרקע שימש כמקור מיקרוביאלי. בעוד כמה תמותה עשתה להתרחש עם צואת אדם כמקור של חיידקים (טבלה 1), טיפול אנטיביוטי לא שינה דבר. כאשר ריכוז של צואה APW היה ב 20 מ"ג / מ"ל, 40 - 50%של הדגים מתו. עם זאת, ריכוז החמצן המומס היה רק 10% (לעומת> 80% בדליים או באקווריומים), ובכך התנאים היפוקסי מבולבלים הפרשנות. כאשר רמות נמוכות יותר של 16 או 10 מ"ג / מ"ל שימשו, שיעורי ההישרדות הותאמו (דו-צדדית הבדיקה המדויקת של פישר, p = 0.95 ומעלה עבור הבדל בין הקבוצות). רמות החמצן המומס שני ניסויים אלה היו 65% ומעלה. Gambusia הם מינים פולשים קשוחים מאוד שיכול לחיות במים באיכות נמוכה. יהיה מעניין להשתמש אלה מבחני חשיפת חיידקים טבעיים לאמוד הישרדות של מינים אחרים נגד אתגר של מים מזוהמים. דוגמאות של מי מאתרים סביבתיים ספציפיים, במיוחד אלה נתונים eutrophication, יכול לשמש assay דומה, אם כי איכות מים (מומס O 2, ניטראט, מליחות, וכו.) היה צריך להיקבע, כגורם בלבול פוטנציאלי.
דואר דגיםXposed כדי ריפמפיצין היה יותר רגיש ללחץ האוסמוטי מאשר דגים מלאים (איור 3). המבחן log-rank ציין הבדל מובהק (p = 0.049) ב שיעור ההישרדות (מוות 43% בקבוצת הביקורת ו -88% למוות בקבוצה שטופלה, n = 9 בשתי הקבוצות) כאשר קרא תיגר עם מליחות גבוהות. תוצאות assay זה הסכימו עם קביעה של 18.1 מ"ג / מ"ל כמו 50 LC עבור NaCl עם ג affinis ב 24 שעות במים מתוקים 20. סימנים של מתח מלוח כי תערוכת דגים כוללים אדמומיות סביב הפה וירידה שחי תנועה. עם assay זה, רמות מליחות מעל 18 מ"ג / מיליליטר שהסתיימו במות דגים מהיר.
כאשר נחשף חנק רעלן בעמודת המים, טרום חשיפה לאנטיביוטיקה לא השפיעה הישרדות (טבלה 2). עבור כל ניסוי, מוות נרשם בשנייה נקודת זמן קצרה וארוכה, המייצג תופעות אקוטיות יותר כרוניות. הריכוזשל 10 מ"ג / מ"ל נבחרה על סמך היותה LD 50 עבור ג affinis במים מתוקים 48 שעות 21. תוצאות assay זה תאמו ערך LD 50 זה, עם הקטלניות 50% בשתי הקבוצות שטופלו ובקרה אחרי 90 שעות. אתגר גבוה של חנקות (17.5 מ"ג / מיליליטר) נבחן גם, המוביל למוות מהיר יותר. שוב לא היה הבדל קבוצות טיפול. הניטריט הוא דרמטי יותר רעילים מאשר ניטראט ג affinis, עם LD 50 של 0.0015 מ"ג / מ"ל ב 48 שעות 22. לאנליזה ביוכימית קהילה באמצעות מערכת האינדקס לפרופיל אנליטית (לא פורסם) מראה כי חיידקי דגי העור יש פוטנציאל להפחתה חנק. עם זאת, רמות ניטריט ב APW במהלך הניסויים הן נותרו מתחת לגבול הגילוי (0.001 מ"ג / מ"ל). שיטת אתגר זה יכול לשמש עם כל כימיקלים מסיסים קטנים.
כאשר אינדיבידואלי בכוסות ושנאים הפדהוא אותה כמות לכל דגים למשך חודש, מגמה נצפתה לדגים שטופל באנטיביוטיקה כדי לא לעלות במשקל, כמו גם בקרת דגים, ללא הבדל מובהק סטטיסטי (מידע לא מוצג). כדי למנוע את הלחץ של אינדיבידואליזציה, דגים שוכנו יחד כקבוצה לדגי מטופלים ואינם מטופלים בדליים במשך חודש ובהתחשב בסכומים מתאימים של מזון. המגבלה של התקנה זו היא כי דגים עלולים לא לקבל אותו האוכל על בסיס פרטני. עם זאת, במודל הקבוצה, מטופלי דגי דגים ממוצעים אבדו משקל ושליטה על משקל צבר ממוצע (טבלה 3). כמות מזון לדגים היו רבים לא נראית להיות מושפעת חשיפה לאנטיביוטיקה לפני, כך דיכוי תיאבון הסבר מועמד סביר מחוסר במשקל. רבים גורמים אחרים יכולים לתרום, לרבות שינויים דלקת במעיים, רמות ייצור ריר, חדירות המעי, ו / או תנועתיות המעיים. יתרון עיקרי של assay זה כדי למדוד תזונהתופעות onal היא פשטות. זה זול, ורק דורש איזון מעבדה כמו מכשור. היא מתאימה למסך השפעה, מה שמוביל ניסויים מעורבים אחרים כדי לקבוע מנגנון.
גורם דוגמא אחת לבחון קשור לעלייה במשקל דגים הוא זמן מעבר מזון, אשר קשור בטן תנועתיות. dextran FITC שכותרתו ניתן לשלב מזון gelatinized והוא קטלן לדגים. מדידת הקרינה במים שמסביב לאורך זמן נותן מדידה של כמה מהר-dextran FITC עובר דרך המעיים. קרינה מעל רקע ניתן לאתר בהקדם 2 שעות, עם מקסימום הגיע לאחר 16 שעות לאחר ההאכלה (איור 4). תוצאה זו עם דגי בקרת אקווריום. תוצאות אמינות מדגים שטופל באנטיביוטיקה טרם הושגו. מגבלה אחת של שיטה זו היא בכך תקופה רעבה 2-ד נדרשה לדגים לאכול את האוכל. עו"ד antage של הפרוטוקול הוא רגישות גבוהה (קרינת רקע נמוכה), כמו אכילת דגים רק סעיף מזון אחד יכול לתת תוצאות, למרות נתונים עקביים יותר כאשר שני סעיפים נאכלים. פרוטוקול זה הוא פחות מסובך ממה בשיטה דומה וקטלנית לעכברים 23.
איור 1: סקירה כללית סכמטי של פרוטוקול הניסוי המשותף. A הוא ממחישות תרשים זרימה, משמאל לימין, הדגים הועברו מטנק האקווריום, מופרד לקבוצות אנטיביוטיות שטופל (מיוצג על ידי מים אדומים) או מלאות (כחולות), ולאחר מכן להציב לתוך כוסות בודדות כדי לעקוב אחר פנוטיפים. B ו- C מתארים את תהליך חילוץ microbiomes עור בטן דג. לאחר vortexing, חיידקים מושעים לתוך התמיסה לניתוח של קהילת החיידקים.55,170 / 55170fig1large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: פתוגן רגיש. עקומת הישרדות במהלך החשיפה א ictaluri לדגים טרום שטופלה ריפמפיצין (קו אדום) או קבוצת ביקורת שלא טופלה דגים (שחור קו). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: רגישות מתח אוסמוטי. עקומת הישרדות במהלך החשיפה מליחה גבוהה לדגים בשתי קבוצות אנטיביוטיות שטופלו וטופל כראוי. ple ASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מזון Transit Time. הקרינה לאורך זמן בתוך המים משני דגים נמאס FITC-dextran. פיש אכל לשני חלקי ג'לטין מזון והדגים B אכל אחד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
טבלת 1: רגישות סביבות מיקרוביאלית גבוהה. חשיפת הצואה אנושית הוערכה 3 ריכוזים שונים. יחס בין x מוות: y מציג את המספר הכולל של מת דגים בנקודת הזמן המצוינת x לעומת המספר הכולל של דגי y בקבוצת הניסוי.
בתוך-page = "1"> 
טבלה 2: Nitrate רעילות אתגר. הקלטות זמן של תמותת דגים בקבוצות שטופלו ובהנהלתן חשיפת ריכוז החנקות רעילה. יחס בין x מוות: y מציג את המספר הכולל של מת דגים בנקודת הזמן המצוינת x לעומת המספר הכולל של דגי y בקבוצת הניסוי.
טבלה 3: צמיחת ניתוח. שינויים במשקל הגוף הכולל לאחר חודש לאחר טיפול אנטיביוטי או מלאה. ההבדל באחוזים במשקל גוף ממוצע ראשוני (עבור הדגים כי קבוצת הניסוי) לעומת משקל גוף ממוצע סופי הוא בעמודה Δweight. N הוא מספר הדגים בקבוצה זו. המשקל הממוצע לכל דגים בסוף המשפט הוא / דגים בתת משקל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אתגרים מסוימים דורשים תקופת מנוחה ב APW הנקי לאחר טיפול אנטיביוטי עבור התרופה להיות מדולדלת ברקמות דגים. אם תקופת המנוחה הוא דילג אז הנוכחות אנטיביוטי יכול לבלבל את התוצאות, במיוחד כאשר assay כרוכה בחשיפה חיידקים. על מנת לבחון את ההשפעות מתוך רכב Microbiome שינה ללא שינויים גדולים המספר הכולל של חיידקים על המארח, רכב Microbiome ראשונים ניסויי ניטור (פרופיל 16S או רצף הגנום כולו) וצפיפות אוכלוסייה (16S quantitation באמצעות qPCR) במהלך חשיפה לאנטיביוטיקה יהיה נדרש. בעוד 3 ד הוא אופטימלי במערכת זו, שינוי המארח ו / או אנטיביוטיקה תדרוש recalibration.
אופיינית של המחקר הביו-רפואי, במודל עכבר הוא מנוצל בדרך כלל ללימודי Microbiome. מודל הדגים הנפוץ ביותר הוא דג זברה. על מנת לקבל הבנה טובה יותר של המאפיינים האוניברסליים של המבנה והתפקוד של microb הריריתiomes ואינטראקציות מארח, דגמים חדשים לא טיפוסיים הם הכרח. מודל דגי WT שלנו משמש כמקור אותנטי ללימוד אינטראקציות בין מאכסן Microbiome ידי הכללת השתנות גנטית מארח טבעי כי מודלים אחרים אבדו בשל דורות של הכלאות בעלי חיים שגודל במעבדה 24. יתרון ניסיוני גדול של Gambusia הטבע הארדי שלהם, לסבול מגוון רחב של מצבים. בהישרדותם נצפו במים משתנה הטמפרטורה (4 - 38 ° C), מליחות (0 - 17 מ"ג / מ"ל), חמצן מומס (110 - 25%), ו- pH (4 - 8). זה מאפשר לא בחינת תנאים סביבתיים רבים בלבד, אלא גם עבור פרוצדורות רבות שלבים, כי הם לעתים קרובות מדי מלחיצים עבור מיני דגים אחרים.
הנהלים שהוצגו כאן מתאימים לסינון מהיר לגלות תופעות מארח מטיפול מסוים. מחקרי מעקב נדרשים לקבוע סיבתיות מנגנון ישירות. הארכת דוגמא סטאדיes על השפעות מארח דגי Microbiome כולל: מדידת דלקת מעיים, בחינת בריאות דגים על ידי לכימות ממאגרי שומן, ומדידה של רמות ריר על העור במעיים. מערכת gnotobiotic מפותחת ללמוד קישורים בפירוט של חיידקים ספציפיים פנוטיפים שורה מסוימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | Calbiochem | 557303-1GM | |
| Sodium Nitrate | Sigma Aldrich | S5506 | |
| Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran | ThermoFisher Scientific | D1823 | |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets | Calbiochem | 6500-OP | tablets dissolve in water to make PBS |
References
- Panda, S., et al. Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota. PloS ONE. 9 (4), 95476 (2014).
- Perez-Cobas, A. E., et al. Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach. Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).
- Buffie, C. G., et al. Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile. Nature. 517, 205-208 (2015).
- Sekirov, I., et al. Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection. Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).
- Looft, T., Allen, H. K. Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes. Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).
- Magnadottir, B. Innate immunity of fish. Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).
- Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens. Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).
- Nunes, B., et al. Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations. Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).
- Fryxell, D. C., et al. Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish. Proc Biol Sci. , 22 (2015).
- Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure. Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).
- Leonard, A. B., et al. The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective. Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).
- Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome. Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).
- Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes. Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).
- Hawke, J. P., et al. Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio. J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).
- Petrie-Hanson, L., et al. Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC). J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).
- Fultz, R. S., Primm, T. P. A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model. J. Microbiol. Biol. Educ. 11, abstract 20-B (2010).
- Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio). Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).
- Shotts, E. B., Waltman, W. D. A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri. J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).
- Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank. , National Library of Medicine. Available from: https://toxnet.nlm.nih.gov/ (2016).
- Vilz, T. O., et al. Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation. J Vis Exp. (67), e4086 (2012).
- Katoh, H. International Harmonization of Laboratory Animals. National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , National Academies Press. (2000).
